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1、证明线粒体的电子传递和氧化 磷酸化是由两2个不同的结构系 统来实现的 生物工程学院021班向生光前言三羧酸循环等呼吸代谢过程中脱下的氢被NAD+或FAD所接受。 细胞内的辅酶或辅基数量是有限的，它们必须将氢交给其它受 体之后，才能再次接受氢。在需氧生物中，氧气便是这些氢的 最终受体。这种有机物在生物活细胞中所进行的一系列传递氢 和电子的氧化还原过程，称为生物氧化(biological oxidation)。生物氧化与非生物氧化的化学本质是相同的，都 是脱氢、失去电子或与氧直接化合，并产生能量。然而生物氧 化与非生物氧化不同，它是在生活细胞内，在常温、常压、接 近中性的pH和有水的环境下，在一系
2、列的酶以及中间传递体的 共同作用下逐步地完成的，而且能量是逐步释放的。生物氧化 过程中释放的能量可被偶联的磷酸化反应所利用，贮存在高能 磷酸化合物（如ATP、GTP等）中，以满足需能生理过程的需要 。概念v电子传递过程包括包括电子从还原型辅酶通过 一系列按照电子亲和力递增顺序排列的电子载 体所构成的电子传递到氧的过程。v氧化磷酸化作用指的是伴随电子从底物到氧的 传递，ADP被磷酸化形成ATP的酶促过程。氧化磷酸化的机理v在电子传递过程中所释放出的自由能是怎样转 入ATP分子中的， 这就是氧化磷酸化作用的机 理问题。有多种假说，如化学偶联学说、化学 渗透学说和构象学说。不过，目前为大家所公 认的
3、、实验证据较充足的是英国生物化学家米 切尔的化学渗透学说。 经典实验1968年E.Racker等人用超声波将线粒体破碎，线粒体内膜碎可 自然卷成颗粒朝外的小膜泡，这种小膜泡称为亚线粒体小泡（ submitochondrial vesicle）或亚线粒体颗粒（submitochodrial particles）。这些亚线粒体小泡具有电子传递和磷酸化的功能。 如用胰蛋白酶或尿素处理，则小泡外面的颗粒可解离下来，这 样的小泡便只能进行电子传递，而不能使ADP磷酸化生成ATP 。 如果将这些颗粒重新装配到无颗粒的小泡上时，则小泡又恢 复了电子传递和磷酸化相偶联的能力。由此可见，由NADH脱 氢酶至细胞
4、色素氧化酶的整个呼吸链的各种组分均存在于线粒 体内膜中，而颗粒是氧化磷酸化的偶联因子，位于内膜的基质 侧，它是基粒（ATP酶复合物）的组分之一。氧化磷酸化的分子结构基础v电子传递链vATP合成酶的分子结构与组成v氧化磷酸化作用与电子传递的偶 联v氧化磷酸化的解偶联剂和抑制剂结论从以上各方面可以得知，线粒体的电子传递是 由电子传递链来实现的，而氧化磷酸化也就是 ATP的合成是在ATP合成酶中完成的。二者是 偶联的却又是相对独立的。从而说明电子传递 和氧化磷酸化是由两个不同的结构系统来实现 的。电子传递链v所谓呼吸链(respiratory chain)即呼吸电子传递链 (electron tra
5、nsport chain)，是线粒体内膜上由呼 吸传递体组成的电子传递总轨道。呼吸链传递体能把 代谢物脱下的电子有序地传递给氧，呼吸传递体有两 大类：氢传递体与电子传递体。氢传递体包括一些脱 氢酶的辅助因子，主要有NAD、FMN、FAD、UQ等。它 们既传递电子，也传递质子；电子传递体包括细胞色 素系统和某些黄素蛋白、铁硫蛋白。呼吸链传递体传 递电子的顺序是：代谢物NAD+FADUQ细胞色素 系统O2。电子传递链的组成v复合体Iv辅酶Qv复合体IIv复合体IIIv细胞色素cv复合体IV化学渗透假说v1.呼吸传递体不对称地分布在线粒体内膜上 呼吸链上的递氢 体与电子传递体在线粒体内膜上有着特定的
6、不对称分布，彼此 相间排列，定向传递。v2.呼吸链的复合体中的递氢体有质子泵的作用 它可以将H+从 线粒体内膜的内侧泵至外侧。一般来说一对电子从NADH传递到 O2时,共泵出6个H+。从FADH2开始,则共泵出4个H+。膜外侧的H+, 不能自由通过内膜而返回内侧,这样在电子传递过程中，在内 膜两侧建立起质子浓度梯度(pH)和膜电势差(E),二者构成 跨膜的H+电化学势梯度H+，若将H+转变为以电势V为单 位，则为质子动力。v质子的浓度梯度越大，则质子动力就越大，用于合成ATP的能 力越强。v3.由质子动力推动ATP的合成 质子动力使H+流沿着ATP酶（偶 联因子）的H+通道进入线粒体基质时，释
7、放的自由能推动ADP 和Pi合成ATP（图片）。v化学渗透学说已得到充足的实验证据。当把线粒体悬浮在无O2 缓冲液中,通入O2时，介质很快酸化，跨膜的H+浓度差可以达到 1.5pH单位，电势差达0.5V，内膜的外表面对内表面是正的,并 保持相对稳定，证实内膜不允许外侧的H+渗漏回内膜内侧。但 当加入化学渗透假说解偶联剂2,4-二硝基苯酚(DNP)时，跨膜 的H+浓度差和电势差就不能形成，就会阻止ATP的产生。有人将 嗜盐菌的紫膜蛋白和线粒体ATPase嵌入脂质体,悬浮在含ADP和 Pi溶液中，在光照下紫膜蛋白从介质中摄取H+，产生跨膜的H+ 浓度差，推动ATP的合成。当人工建立起跨内膜的合适的
8、H+浓度 差时，也发现ADP和Pi合成了ATP。线粒体中氧化磷酸化反应的一般机理1.复合体 v又称NADH泛醌氧化还原酶(NADHubiquinone oxidoreductase)。 分子量700X103900X103,含有25种不同的蛋 白质,包括以黄素单核苷酸(flav in mononucleotide,FMN)为辅基 的黄素蛋白和多种铁硫蛋白，如水溶性的铁硫蛋白(iron sulfur protein,IP)、铁硫黄素蛋白(ironsulfur flavoprotein，FP)、泛醌 (ubiquinone,UQ)、磷脂(phospholipid)。复合体的功能在于催 化位于线粒体基
9、质中由TCA循环产生的NADHH中的2个H 经FMN转运到膜间空间，同时再经过Fe-S将2个电子传递到 UQ(又称辅酶Q,CoQ)；UQ再与基质中的H结合，生成还原型 泛醌(ubiquinol,UQH2)。该酶的作用可为鱼藤酮(rotenone)、杀 粉蝶菌素A(piericidin A)、巴比妥酸(barbital acid)所抑制。它们 都作用于同一区域，都能抑制Fe-S簇的氧化和泛醌的还原。 2.复合体 又称琥珀酸，泛醌氧化还原酶(succinateubiquinone oxidoreductase)分子量约140103，含有45种不同的 蛋白质，主要成分是琥珀酸脱氢酶(succinat
10、e dehydro genase,SDH)、黄素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide, FAD)、细胞色素b(cytochrome b)和3个Fe- S蛋白。复合体的功能是催化琥珀酸氧化为延胡索 酸，并将H转移到FAD生成FADH2，然后再把H转移到 UQ生成UQH2。该酶活性可被2-噻吩甲酰三氟丙酮 (thenoyltrifluoroacetone,TTFA)所抑制。 3.复合体 v又称UQH2细胞色素C氧化还原酶 (ubiquinonecytochrome c oxidoreductase),分子 量250103，含有910种不同蛋白质，一般都含有2 个C
11、yt b，1个Fe-S蛋白和1个Cyt c1。复合体的功能 是催化电子从UQH2经Cyt bFeSCytc1传递到Cyt c ，这一反应与跨膜质子转移相偶联，即将2个H释放 到膜间空间。也有人认为在电子从Fe-S传到Cyt c1之 前，先传递给UQ，同时UQ与基质中的H+结合生成UQH2 。UQH2再将电子传给Cytc1，同时将2个H+释放到膜间空 间。泛醌线醌线 粒体复合物（细细胞色素c 氧化还还原酶）的假想构成和膜局部构造4.复合体 又称Cyt c细胞色素氧化酶(Cyt ccytochrome oxidase)分 子量约160170103，含有多种不同的蛋白质，主要成分是 Cyta和Cyt
12、a3及2个铜原子，组成两个氧化还原中心即Cyta CuA 和Cyta3 CuB，第一个中心是接受来自Cyt c 的电子受体，第二 个中心是氧还原的位置。它们通过Cu+ Cu2+的变化，在Cyta 和Cyta3间传递电子。其功能是将 Cyt c中的电子传递给分子氧 ，氧分子被Cyta3、CuB还原至过氧化物水平；然后接受第三个 电子，O-O键断裂，其中一个氧原子还原成H2O；在另一步中接 受第四个电子，第二个氧原子进一步还原。也可能在这一电子 传递过程中将线粒体基质中的 2个H+转运到膜间空间。CO、氰 化物(cyanide,CN-)、叠氮化物(azide,N3-)同O2竞争与Cytaa3 中F
13、e的结合，可抑制从Cytaa3到O2的电子传递。线线粒体复合物（细细胞色素c氧化酶）的假想结结构和膜局部结结构 电子传递的方向（图片）黄素蛋白中的FADH2 琥珀酸-Q还原酶 NADNADH-QQ细胞色素细胞色素c还原酶 还原酶细胞色素氧化酶氧图图 5-11 植物线线粒体内膜上的复合体及其电电子传递传递 、分别代表复合体、； UQ库代表存在于线粒体中 的泛醌库ATP合成酶vadenosine triphosphate synthase，又叫H+-ATP酶复 合物。由8种不同亚基组成,分子量分别是8.2103 55.2103，它们又分别组成两个蛋白质复合体(F1-F0) 。F1从内膜伸入基质中，
14、突出于膜表面，具有亲水性 ，酶的催化部位就位于其中。F0疏水，嵌入内膜磷脂 之中，内有质子通道，它利用呼吸链上复合体、 、运行产生的质子能，将ADP和Pi合成ATP，也能催 化与质子从内膜基质侧向内膜外侧转移相联的ATP水解 。图图 5-14 ATP生成过过程中构造变变化的模型。 F1复合物有三个核苷酸结合位点。每一部位有三种完全不同的结构状态。松散的核苷酸结合部位（L），紧密 核苷酸结合部位（T）和开放核苷酸结合部位（O）。在任何时候。F1复合物包括这三种不同的结构，其中有一个 与酶复合物的每一个催化中心相连。ADP和Pi开始被结合到开放状态未被占有的部位（1）。质子运动通过F0释放 能量引
15、起亚单位旋转。这种旋转自发改变了三个核苷酸结合位点的构造。结合有ATP的T型被转变成O型，ATP 被释放出来。同时，结合有ADP和Pi的L型被转化成T型，疏水性的结合正有利于ATP生成。第上步中结合ADP和Pi 的开放部位转化或松散型结构（2）。被紧密结合的ADP和Pi转化生成ATP，此步骤不需消耗能量和构型改变（3 ）氧化磷酸化的解偶联剂和抑制剂1.解偶联剂(uncoupler) 2.抑制剂(depressant) 3.离子载体抑制剂(ionophore depressant)1.解偶联剂(uncoupler) v植物在遇到干旱或某些化学物质作用时，会抑制ADP 形成ATP的磷酸化作用，但不
16、抑制电子传递，使电子 传递产生的自由能以热的形式散失掉,导致氧化过程与 磷酸化作用不偶联,这就是氧化磷酸化解偶联现象。能 对呼吸链产生氧化磷酸化解偶联作用的化学试剂叫解 偶联剂。最常见的解偶联剂有DNP，含有一个酸性基 团的DNP是脂溶性的，可以穿透线粒体内膜，并把一 个H+从膜外带入膜内，从而破坏了跨内膜的质子梯度 ，抑制了ATP的生成。解偶联时会促进电子传递的进 行，O2的消耗加大。2.抑制剂(depressant) v抑制剂与解偶联剂的区别在于,这类试剂不仅抑 制ATP的形成，还同时抑制O2的消耗。这是因 为像寡霉素(oligomycin)这一类的化学物质可以 阻止膜间空间中的H+通过ATP合成酶的Fo进入 线粒体基质，这样不仅会阻止ATP生成，还会 维持和加强质子动力势,对电子传递产生反馈抑 制,O2的消耗就会相应减少。 3.离子载体抑制剂(ionophore
