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1、姜黄素通过抑癌因子HLJ1 抑制肺癌细胞的侵袭和转移摘要姜黄素是姜黄根的一种活性成分，它有很多种抗癌活性。 在这项研究中， 我们发现，姜黄素能够通过激活一种叫做热休克蛋白40 的抑癌因子来抑制癌细胞的侵袭和转移。用浓度为1-20 M 的姜黄素处理人肺腺癌细胞发现，肺腺癌的迁移，侵袭和转移能力对姜黄素呈现浓度依赖性，而且这种依赖性和和HLJ1 的表达关系密切。 而通过 siRNA 敲除 HLJ1 的表达，则能在体内和体外逆转它的抗侵袭和抗转移效应。在一篇荧光素酶的报道中关于HLJ1 启动子和增强子的部分显示，在转录中姜黄素能通过在增强子里激活AP-1 蛋白位点来上调 HLJ1 的表达。姜黄素（
2、1-20 M）能极大地上调一种AP-1 成分 junD 的表达 ,而且呈现出浓度依赖性和时间依赖性。敲除junD 的表达能够部分降低姜黄素诱导的HLJ1 的激活和减少姜黄素的抗侵袭效应，这表明junD 从某种程度上参与了姜黄素诱导的HLJ1 的表达。姜黄素能诱导c-jun 胺基端激酶磷酸化，而c-jun 胺基端激酶的抑制剂（ sp-600125）能够减弱姜黄素诱导的c-jun 和 HLJ1 得表达。姜黄素活化的HLJ1 能够进一步引导上皮细胞钙粘蛋白的上调和癌细胞侵袭能力的下降。这是一种新的机制，支持它被应用于抗癌转移治疗中。前言姜黄素，姜黄根中的一种活性成分， 能够通过很多种信号转导通路抑制
3、癌细胞的增殖，侵袭，血管生成以及转移，这些通路包括factor-B, IBa kinase, Akt, activator protein (AP-1), mitogen-activated protein kinase, cyclooxygenase-2(COX-2), lipoxygenase, inducible nitric-oxide 合酶, 尿纤溶酶启动子，瘤坏死因子，化学激酶，细胞表面粘附分子，cyclin-D1 等等。人类临床试验已经证实，当姜黄素给药剂量为 10 g/day 时，没有剂量限制毒性；当给药剂量为8 g/day 时，姜黄素的血药浓度为 1.771.87 M。这些研
4、究表明姜黄抗癌治疗中有很大的潜力。然而对这种药物的机制有很好的了解有助于我们研究姜黄素单药以及联合用药治疗癌症。 通过协同调节例如增殖， 侵袭和转移等癌细胞的特性能够使抗癌成为可能。为了呈现一种更有力的视角， 我们从 DNA 和 mRNA 角度分析姜黄素的抗肺癌机制，并且标识了一组姜黄素的候选靶点。其中一些靶点和癌细胞的侵袭和转移能力密切相关。有趣的是，其中一个靶基因是热休克蛋白，也叫做DNAJB4,这种热休克蛋白最近被克隆并归类为HSP40家族的成员。 HSPs被公认为分子伴侣。他们能够被热和很多种物理和化学应激所诱导。最近发现 HSPs和人类的很多种癌症的进化相关，而且 HSPs能够调节癌
5、细胞的增殖，分化，侵袭，转移以及凋亡。某些HSPs已经被用作诊断和预后的生物标记，以及抗癌进展中的有用的新靶点。HLJ1 是姜黄素的新的候选靶点，属于HSP40家族，它见于整个细胞，并且在真核染色体中显示出很高的变异性。至少有44 种基因在人类的染色体中出现过。我们曾经报道过HLJ1 能够抑制肺癌细胞的增殖，抑制不贴壁细胞的生长，抑制肿瘤生成，细胞活力，侵袭以及细胞周期的进化。HLJ1 的高表达和癌症的低复发率以及非小细胞癌的高存活率成正相关。在癌细胞中内源性的控制HLJ1的转录是通过转录因子YY1 和 AP-1 调节的。这种新的抑癌基因和抑制侵袭基因HLJ1 也许是一种潜在的抗癌治疗的靶点。
6、几项研究已经表明姜黄素能够抑制癌细胞的侵袭和转移，我们以前的研究显示姜黄素不但就能够影响金属蛋白MMP,而且能够调节抑癌基因以及抑制侵袭能力的因子 HLJ1 的表达。在这项研究中，我们发现姜黄素的抗侵袭和抗转移效应是通过 HLJ1 上调的，这种机制是通过JNK/junD 途径实现的，同时它的抑制肺癌细胞的侵袭和转移是通过调节上皮细胞钙粘蛋白的表达实现的。材料和方法细胞株和培养条件具有 CL1-0 低侵袭能力和 CL1-5 高侵袭能力的人肺腺癌细胞株已经被建立。人肺癌细胞株 A549 购自 ATCC 公司。细胞培养于DMEM 培养基，加 10%胎牛血清，并加入青霉素和链霉素（100 mg/ml）
7、 ，置于 37 摄氏度含 5%CO2的培养箱中。转移实验癌细胞转移实验室通过划痕愈合实验评估的，通过小室的转移实验如我们以前描述的做了适当修改。划痕愈合实验含 10%胎牛血清的细胞培养于24 孔板中，待单层贴壁融合，用塑料的移液管在每个孔的细胞上划一直线的伤痕，然后用PBS 缓冲液洗两次。把浓度分别为 1 M，5 M，10 M，20 M 的姜黄素加至小孔中，对照孔加0.1%的 DMSO 作为阴性对照。加完后立刻拍照，以后每隔20 分钟拍一次照，直至12小时。在显微镜下，转移至空白区域的细胞数以及伤痕的宽度都作为评估的指标。本实验每个孔设三个复孔，重复三次，并且要至少两个观察者在双盲的情况下进行
8、。TRANSWELL转移实验TRANSWELL转移实验是按照以前的实验进行的并做了部分的修改。简要的说，TRANSWELL 膜的孔径为 8 m ，直径为 6.5 mm。CL1-5 细胞用胰蛋白酶消化后，重悬于没有FBS 的培养基中。在底层小室中加了诱导转移的含PBS的培养基。上层为不含血清的细胞，数量为2104/孔。在一些小孔中加入不同浓度的姜黄素（ 1-20m ） ，阴性对照里加0.1%的 DMSO。将小室置于潮湿的培养箱中。8 小时后，移除顶层细胞，并小心移除过滤器。过滤器浸没于甲醇中固定然后把顶层的细胞擦掉。 过滤器用吉姆萨染料染色。 评估这种跨过小室的迁移要在显微镜下进行，仅滤过膜的底
9、层细胞的存在用于随机检测。癌细胞侵袭实验癌细胞在经过药物处理和没经过药物处理情况下的侵袭能力测试时利用我们以前描述过的 TRANSWELL 实验来测试的。 TRANSWELL 膜的孔径为 8 m ，直径为 6.5 mm，购自 Corning costar 公司。膜的上面涂上一层基质胶用于侵袭实验。细胞被消化，离心后用 DMEM 培养基重悬，密度为 1 107/ml。 在已经 coating 好的上层小室铺上2 104个细胞，下层同样处理后涂上同样的细胞，不过要加上 10%胎牛血清。经过18 小时的培养，顶层细胞和上层铺有基质胶的膜用Q-TIP 除去，用甲醇固定， 用吉姆萨染料染色。 贴于聚碳酸
10、酯滤器底层的细胞在显微镜 下计数，重复三次。 动物体内试验我们是严格遵守国家YANG-MING 大学承认的动物关爱和使用协会的规则条例来进行动物实验的。 CL1-5 细胞用 HLJ1转染 24 小时或用 Scramble 处理过，胎盘蓝染色计数，以 5 105 个细胞/100 l PBS的浓度尾静脉注入8 周大的严重免疫缺陷的小鼠中。 为了验证姜黄素对 HLJ1 转染的 CL1-5 细胞在小鼠肺部癌细胞聚集的影响， 我们把被处理过的小鼠模型随机分为药物处理组和阴性对照组。姜黄素为悬浮液，灌胃给药，每天一次，给药剂量为1g/kg，给药持续 5 周。5 周后处死小鼠，摘除小鼠的肺脏用于分析，将小鼠
11、肺脏用PBS 清洗后，置于装有Bouin,s的烧杯中。 24 小时后，肺脏用水洗去表面残留的Bouin,s 溶液，然后瘤集落在立体显微镜下计数，并用H&E 组织染色或人纤维蛋白免疫染色计数验证。RT-PCR HLJ1 的 表 达 水 平 是 利 用RT-PCR 来 测 定 的 。 HLJ1 引 物 如 下 ：5?-CCAGCAGACATT-GTTTTTATCATT-3?，反转录引物如下：5?-CCATCCAGTGTTGG-TACATTAATT-3?。TBP 用来做内部对照。引物特探针如前所述。和 TBP相比 HLJ1 的表达定义为： -CT= -CTHLJ1-CTTBP 。HLJ1 的 mRN
12、A/TBP的 mRNA=2- CTk，k 为常数。本实验一式三份重复3 次。凝胶电泳，免疫荧光颜色，流式细胞计数凝胶电泳和免疫荧光染色是用来测定用姜黄素处理前和处理后HLJ1, c-Jun, JunB, JunD, Fra-1, Fra-2, 和 E-cadherin 等蛋白的表达水平的，而流式是用来测定用姜黄素处理后钙黏连蛋白的。具体过程如前所述。主要的c-Jun, JunB, JunD, c-Fos, Fos-B, Fra1, and Fra2 的抗体购自 Santa Cruz 生物技术有限公司。 钙黏连蛋白购自 BD 生物。 主要的 HLJ1 生产于 HOUSE。 单克隆鼠抗体用于Loa
13、ding 对照。膜用 TBST 洗 3 次，然后用二抗（ 1：4000）在脱脂奶粉中孵育。增强荧光染色检测抗体。用 LAS 3000 系统捕捉化学信号。 所有的实验至少一式三份进行两次。FITC 共轭的二抗用于免疫荧光染色。碘根染料用于细胞核染色计数。染色 的细胞在共聚焦荧光显微镜下放大400 倍计数。细胞用钙黏连蛋白抗体和FITC 共轭得二抗处理后在流式细胞计数器下计数，实验一式三份进行3 次。 HLJ1 启动子和增强子以及荧光素酶报告基因构造为了克隆假设的 HLJ1 基因的启动子或增强子， PCR 用于检测， 根据我们以前研究中的HLJ1 启动子序列的5 末端用于设计特定的引物。把扩增的长
14、度为2302 bp 的DNA 片 段 克 隆 到 缺 少 启 动 子 的 PLG3-BASIC 媒 介 来 构 造PLG3-FRER。根据我们以前的工作， 已经具备各种长度的5 端侧翼区域的 HLJ1片 段用 于荧 光素 酶实 验。 PLG3-CONTROL ，一 种阳性 对照 的质 粒 来 自于Promega 。 我们假定的增强子和用PCR 制造的它的各种缺失突变株如前所述的被亚克隆如 PLG3-启动子媒介。这个媒介包含被 SV40 启动子驱动的荧光素酶基因。同样的方法用于制造小增强子构造PLG3-Emi。为了定点突变试验 ,PLG3-Emi 作为 AP-1 和 SP1 联合位点突变的模板。
15、所有的突变片段都是PCR 利用包含突变的引物制造的。所有构造都经过核酸内切酶消化和DNA 测序。转染和荧光素酶报告基因实验所有的转染都在 6 孔板中进行， 每个孔设 3 个复孔，详细规则按照我们以前的研究进行。 CL1-5 细胞（2 105个细胞 /孔）转染前 24h 铺于 6 孔板中。质粒利用 Lipofectamine 2000 试剂根据生产商的使用说明书转染到细胞中。HLJ1 启动子，增强子，荧光素酶报告基因以及对照的质粒在 -galactosidase 和 pSV- -Gal存在的情况下共转染。荧光素酶报告基因的DNA 含量与 -galactosidase 构造的比为 3:1。细胞在转
16、染混合物中孵化4h，然后在培养 44h 后收细胞。一部分细胞用于荧光素酶活性实验， 另一部分细胞用于测定 -galactosidase 的活性。转染效率利用 -GAL 规范化。所有的实验重复至少3 次。Actin 染色法细胞用 PBS 洗两次，在室温下置于 0.37%的甲醛 -PBS 溶液中 10 分钟。再用PBS洗两次，细胞在 PBS 中用 0.1%的 TritonX100 透化处理 3-5 分钟，然后再用PBS 洗两次。0.2 g/ml 的鬼笔环肽和 9 g/ml 的 Alexa Fluor 488 DNase I 结合物分别用来 Localize F-actin 和 G-actin，正如 Gramer 和他的同事所描述的一样。荧光染料用封闭液（ 1%的牛血清白蛋白和0.025%皂苷溶解于 PBS 中）溶解，在室温下加到盖玻片上40 分钟， 再用 PBS 洗 3 次， 然后盖上盖玻片在显微镜下计数。调节到最佳图像质量并保持到实验结束。当F-actin 和 G-actin 荧光比例定量化，视野下的细胞 30 个时用
