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1、细菌内毒素光度测定法试验讲义讲解 董光宴1、光度测定法概述2、试剂和仪器 3、标准曲线 4、干扰试验 5、检查法 湛江博康海洋生物有限公司DateDate1 1博康博康www.zj-www.zj-一、光度测定法概述1、定量法的概念2、定量法的分类3、定量法的原理DateDate2 2博康博康www.zj-www.zj-1 定量法的概念光度测定法分为浊度法和显色基质法：浊度法系利用检测鲎试剂与内毒素反应过程中 的浊度变化而测定内毒素含量的方法。根据检测原 理，可分为终点浊度法和动态浊度法。动态浊度法 是检测反应混合物的浊度到达某一预先设定的吸光 度所需要的反应时间，或是检测浊度增加速度的方 法。
2、 DateDate3 3博康博康www.zj-www.zj-定量法浊度法显色基质法动态浊度法终点浊度法2 定量法分类DateDate4 4博康博康www.zj-www.zj-3 定量法的原理（1）动力学曲线：细菌内毒素与鲎试剂反应过程中，随着反应的进行，混合物会逐渐变混浊，内毒素浓度越高浊度变化越快，浊度变化符合反应动力学曲线。DateDate5 5博康博康www.zj-www.zj-（2）细菌内毒素含量与时间的关系：细菌内毒素浓度与反应时间分别取对数后，将两组数据用最小二乘法统计，可以得到直线：LgT=a+bLgC我们将这条直线称为标准曲线。DateDate6 6博康博康www.zj-www
3、.zj-（3）、数学原理原理：OD=-Lg（It/Io）0.02=-Lg（It/Io）It=95%IoDateDate7 7博康博康www.zj-www.zj-二 试剂和仪器光度测定法鲎试剂（生产单位：湛江博康海洋生物有限公司，批号：0907104，检测限：0.015EU/ml；规格为1.25ml/支）细菌内毒素检查用水（生产单位：湛江博康海洋生物有限公司，批号：0908030，规格：2ml/支）* *8 8博康博康www.zj-www.zj-细菌内毒素工作标准品（200966，120EU/支，中国药品生物制品检定所提供）氯化钾注射液（规格：1g/10ml 批号：0911211，生产厂家：河北
4、某制药厂） 细菌内毒素定量检测仪（生产单位：天大天发科技有限，型号：BET-72）DateDate9 9博康博康www.zj-www.zj-三 标准曲线 1、制作标准曲线的条件2、标准曲线的选择3、标准曲线的制作4、标准曲线有效的条件 5、结果分析DateDate1010博康博康www.zj-www.zj-1 制作标准曲线的条件l当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能会影响检验结果的改变时，需进行标准曲线的可靠性试验。l用标准内毒素配成溶液，并制成至少3个浓度的稀释液（相邻浓度间稀释倍数不得大于10），最低浓度不得低于所用鲎试剂的标示检测限。 DateDate1111博康博康www.zj
5、-www.zj-2 标准曲线的选择制做标准曲线的内毒素浓度可选择10倍、5倍、4倍和2倍稀释的等比系列点，也可选择非等比系列点。一般情况下，我们不推荐10倍和2倍等比系列点，10倍等比系列点（如10EU/ml、1EU/ml、0.1EU/ml和0.01EU/ml）跨度大，其相关系数R和准确性都受到一定限制；DateDate1212博康博康www.zj-www.zj-2倍等比系列点（如0.5EU/ml、0.25EU/ml、0.125EU/ml和0.06EU/ml）跨度太小，其相关系数R和准确性都较好，但很不实用。我们推荐选用4倍等比系列点（如2EU/ml、0.5EU/ml、0.125EU/ml和0
6、.03EU/ml）跨度适中，其相关系数R和准确性都较好，而且非常实用。DateDate1313博康博康www.zj-www.zj-3 标准曲线的制作3.1 内毒素标准品的溶解稀释首先将细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水1ml溶解，在旋涡混合器上混匀15分钟，然后制备成2EU/ml、1EU/ml、0.5EU/ml、0.125EU/ml和0.03EU/ml备用。DateDate1414博康博康www.zj-www.zj-200EU/ml20EU/ml2.0EU/ml1.0EU/ml0.5EU/ml0.03EU/ml0.125EU/ml0.3ml0.3ml2.7ml2.7ml1.5ml1.5m
7、l1.5ml1.5ml1.5ml1.5ml0.5ml0.5ml图 示DateDate1515博康博康www.zj-www.zj-3.2 定量法鲎试剂的溶解分装将复溶好的光度测定法鲎试剂分装到14支定量分析专用试管中，每管分装0.1ml。定量法鲎 试剂定量试管每管0.1mlDateDate1616博康博康www.zj-www.zj-3.3 加 样将内毒素加入定量分析专用试管中，每个浓度做3支平行管，剩下两管加入BET水作为阴性对照，每管加样量均为0.2ml 。2EU/ml0.5EU/ml0.125EU/ml0.03EU/mlBET水DateDate1717博康博康www.zj-www.zj-注：
8、产品名称：有机玻璃试管架 用 途：细菌内毒素检查定量法中用于摆放小试管。 特 点：有机玻璃材料可保护定量法小试管，避免定量法小试管被磨花而影响试验结果。DateDate1818博康博康www.zj-www.zj-3.4 检 测加样完毕后用封口膜密封试管，将每支试管在旋涡混合器上点1-3秒，然后将试管对应插入已恒温的定量检测仪（37），仪器开始自动采集数据。注：封口膜的优点 规 格：4IN35FT（4英寸35英尺） 特 点：进口代销 ，比较适合用于定量法专用 试管的封口，清洗时不留任何残留物。 DateDate1919博康博康www.zj-www.zj-4 标准曲线有效的条件l当阴性对照的反应时
9、间大于标准曲线最低浓度的反应时间，将全部数据进行线性回归分析。l根据线性回归分析，标准曲线的相关系数（r）的绝对值应该大于或等于0.980，试验方为有效。l平行管的变异系数10%。DateDate2020博康博康www.zj-www.zj-5 结果分析 内毒素反应时 间变异系数实测内毒素072000 07200 2.07900.36%2.0118 2.0794 0.511591.01%0.5022 0.51140 0.12516200.34%0.1217 0.1251634 0.0323980.04%0.0318 0.032381标准曲线：LogT=2.9783-0.2621LogC，相关系数
10、：=-0.9999,标准曲线符合规定。 DateDate2121博康博康www.zj-www.zj-四 干扰试验1、限值的确定2、干扰试验浓度的计算3、检测浓度的选择4、干扰试验溶液的制备5、供试品溶液的稀释6、干扰试验的制备方法7、干扰试验加样 8、判断的标准9、试验结果分析 10、结 论DateDate2222博康博康www.zj-www.zj-1 限值的确定2010版中国药典二部正文1014页【氯化钾注射液】。L=0.12EU/mgDateDate2323博康博康www.zj-www.zj-2 干扰试验浓度的计算按照中国药典2010年版提供的公式计算最大有效稀释倍数（注：其中标准曲线的最
11、低点为0.015EU/ml）。最大有效稀释倍数：MVD= CL/=100 0.12/0.015=800倍 * *2424博康博康www.zj-www.zj-3 检测浓度的选择样品限值表达方式为EU/ml，直接选用其无干扰浓度并填写相应稀释倍数即可；样品限值表达方式为EU/mg ，无论其干扰情况如何，我们推荐以1mg/ml为初始浓度，选用其以下的无干扰浓度并填写从1mg/ml开始的相应稀释倍数，这样检测结果即为样品每ml或mg中内毒素的量。我们将检测结果直接与限值比较即可。DateDate2525博康博康www.zj-www.zj-4 干扰试验溶液的制备编 号内毒素浓度 被加入内毒 素的溶液 平
12、行管数A无1.0mg/ml或0.5mg/ml 至少2 B标准曲线的中点（或附近点 ）的0.5EU/ml（设为 m） 1.0mg/ml或0.5mg/ml 至少2 C2.0EU/ml、 0.5EU/ml、 0.125EU/ml 、0.03EU/ml四 个浓度 检查 用水每一浓度 至少2 D无检查 用水至少2 DateDate2626博康博康www.zj-www.zj-5 供试品溶液的稀释用细菌内毒素检查用水将氯化钾注射液稀释到2.0mg/ml、1.0mg/ml和0.5mg/ml备用。操作过程必须严格遵守无菌操作规程，保证无外源物质的干扰。 DateDate2727博康博康www.zj-www.zj
13、-10.0mg/ml 2.0mg/ml1.0mg/ml 0.5mg/ml 0.3ml2.7ml1.0ml1.0ml0.3ml4.0ml1.0ml0.3ml100mg/ml 图 示DateDate2828博康博康www.zj-www.zj-6 干扰试验的制备方法取氯化钾注射液的2.0mg/ml 、1.0mg/ml稀释液分别加入四支试管中，每管加0.3ml，然后分别吸取0.3ml的内毒素标准溶液，浓度为1.0EU/ml按下图加入其中两支试管中，另外吸取0.3ml的检查用水加入其中另外两支试管中。将这四支管混合均匀即可得到氯化钾注射液的1.0mg/ml、0.5mg/ml稀释液干扰试验所需样品溶液。D
14、ateDate2929博康博康www.zj-www.zj-氯化钾 注射液内毒素标 准溶液 1.0EU/ml0.3ml0.3ml0.3ml (2.0mg/ml)0.3ml (2.0mg/ml )0.3ml (1.0mg/ml)0.3ml (1.0mg/ml )BET水0.3ml0.3ml图 示DateDate3030博康博康www.zj-www.zj-7 干扰试验加样取分装了0.1ml定量法鲎试剂的定量专用试管10支，每个浓度做2支平行管，氯化钾注射液的1.0mg/ml、0.5mg/ml稀释液干扰试验各4支；另做2支阴性对照，每管加样量均为0.2ml。加样完毕后密封试管，将每支试管在旋涡混合器上
15、点1-3秒，然后对应插入定量检测仪，仪器开始采集数据。 DateDate3131博康博康www.zj-www.zj-0.1ml鲎试剂0.1ml鲎试剂0.1ml鲎试剂1mg/ml的加样0.2ml0.2ml0.5mg/ml的加样0.2ml阴性对照图 示DateDate3232博康博康www.zj-www.zj-8 判断的标准按所得线性回归方程分别计算供试品溶液和含标准内毒素的供试品溶液的内毒素含量Ct和Cs，再按下式计算该试验条件下的回收率（R）。 R=(CS-Ct)/m100%当内毒素的回收率在50%-200%之间，则认为在此该试验条件下供试品溶液不存在干扰作用。 DateDate3333博康博康www.zj-www.zj-图 示回收率：R=(
