《{07C26A16-3883-499F-83F8-A84632E16868}.激光共聚焦与OCT》由会员分享，可在线阅读，更多相关《{07C26A16-3883-499F-83F8-A84632E16868}.激光共聚焦与OCT（39页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、共聚焦激光扫描（荧光）显微镜 n 激光扫描共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscope LSCM)是20世纪80年代发展起来的一项具有 划时代意义的高科技新产品，是当今世界最先进的细胞 生物学分析仪器。激光共聚焦显微镜利用激光作为光源 ，在传统光学显微镜基础上采用共轭聚焦的原理和装置 ，以及通过针孔的选择和PMT的收集，并带有一套对其 所观察到的对象进行数字图像分析处理的系统软件。与 传统光学显微镜相比，它具有更高的分辨率，实现多重 荧光的同时观察并可形成清晰的三维图象等优点。所以 它问世以来在生物学的研究领域中得到了广泛应用。 共聚焦激光扫描显微镜n共聚
2、焦激光扫描显微镜(Confocal Laser Scanning Microscope ,CLSM) 是1987年面世并发 展起来的一种先进的细胞生物学分析仪器,是一项 具有划时代意义的高科技新产品,是近代生物医学 图像分析仪器最重要的发展之一,有细胞“CT”之称 。成为形态学、分子细胞生物学、神经科学、药 理学、遗传学等领域中新一代较有力的研究工具 。n减少由于光散射产生的图像模糊n增加有效分辨率n提高信噪比n厚标本的清楚细查nZ轴扫描n可以实现数字放大倍率的调节共聚焦显微镜的优点Wide-field microscopyFluorescent MicroscopeObjectiveArc
3、LampEmission FilterExcitation DiaphragmOcularExcitation FilterConfocal microscopyConfocal PrincipleObjectiveLaserEmission PinholeExcitation PinholePMTEmission FilterExcitation FilterFluorescent MicroscopeObjectiveArc LampEmission FilterExcitation DiaphragmOcularExcitation FilterObjectiveLaserEmissio
4、n PinholeExcitation PinholePMTEmission FilterExcitation FilterConfocal Microscope原理示意图光源（激光） 二色镜。 物镜 样品 针孔 检测仪 共焦显微镜的最大优点是可以只 从一个平面收集光。 针孔同焦平面成对（即共焦）， 使得来自焦平面以外的光远离检 测仪。 激光扫描显微镜按顺序一点一点 地、一行一行地扫描样品，将象 素资料合成一个图象。通过移动 焦平面，单个图象（光限幅）可 以放在一起，形成可以以后进行 数字处理的三维栈。How a Confocal Image is FormedCondenser LensPi
5、nhole 1Pinhole 2Objective LensSpecimenDetectorModified from: Handbook of Biological Confocal Microscopy. J.B.Pawley, Plennum Press, 1989激光束分光器组织样品探测器 小孔聚焦透镜物镜光学扫描 Quarter Wave Plate基于共聚焦原理的皮肤在体三维成像技术基于共聚焦原理的皮肤在体三维成像技术窗口色素痣AB明亮的黑素细胞巢围绕真 皮乳头呈圆形或椭圆形分布， 细胞形态规则，大小及明亮度 均一。细胞间有间隔。对皮肤疾病的治疗与疗效评 估需要先进的皮肤诊断技术1
6、.无创、原位、动态、即时2.对可疑皮损部位可进行多次、重复观察3.提供客观、量化的评估指标皮肤影像学内窥式激光共聚焦显微镜J。Knitrtel et. al. optics communications 188(2001)267-273横向分辨率为 3.1um；轴向 分辨率为 16.6umIn vivo fiber-optic confocal reflectance microscope with an injection-molded plastic miniature objective lensFibered Confocal Fluorescence Microscopy光学低相干层
7、析成像（OCT ）背景 生物医学光子学是光学与生命科学相互交叉、相互 渗透的一个边缘学科，是关于光辐射与生物组织之 间相互作用的学问。光学技术在生物医学中应用由来已久，早在17世纪 ，光学显微镜的发明将医学研究提高到细胞形态学 水平。二十世纪七十年代之后，激光技术已成为临床治疗的有 效手段：激光诊断(以激光作为信息载体) 激光纤维内窥镜； 激光扫描共焦显微镜； 激光多普勒血流计； 激光光谱诊断技术；激光治疗(以激光作为能量载体) 光动力疗法治癌； 激光外科手术； 准分子激光角膜成形术；等简介进入二十世纪九十年代，由于医学对无辐射损伤、高分辨率层 析成像的需求，光学相干层析成像技术（OCT，Op
8、tical Coherence Tomography）孕育而生，并逐渐成为该领域的研究 热点。 OCT是继超声、X射线、核磁共振等层析成像技术之后，又一种 新型的层析成像技术。 OCT将激光技术、超灵敏光电探测、精密自动控制和计算机图 像处理等多项技术综合为一体。光学相干层析成像（Optical Coherence Tomography, OCT）作为 一种全新的光学层析成像技术，以其无辐射、非侵入、高分辨 率及高探测灵敏度等特点，在临床医学领域具有巨大的发展前 景。发展历史 光学低相干反射测量技术（OLCR） OLCR最早形成于七十年代，它利用低相干光干涉原 理测量反射光的幅度和相对相位，从
9、而获取传输介 质的内部信息。 用途：集成光纤器件的特征或瑕疵检测。1991年，美国的麻省理工学 院的J. G. Fujimoto和D. Huang等人成功地开发了光 学相干层析成像技术，该技 术结合了共焦显微术和低相 干光的外差探测技术，通过 快速扫描实现二维或三维层 析成像。光学相干层析成像技术的优点 1)无辐射损伤、非侵入性与X射线、核磁共振（MRI）等有损层析成像技术相比，OCT具 有无比的优越性。2)高灵敏度 由于引入了外差探测，其探测灵敏度远远高于直接探测。典型 的OCT系统可达到90dB100dB的探测灵敏度，能够探测来自高 散射生物组织23mm深度的光学信号，例如：浅表皮肤。 3
10、)高分辨率OCT图像的轴向分辨率和横向分辨率互不相关，它能提供独立 于横向分辨率的近似于微米量级（110m）的轴向分辨率。 4)结构简单、成本低廉OCT成像装置的核心是迈克尔逊干涉仪，成像原理简单，制造 成本相对较低，各种光学器件和检测设备易于在市场中购买。 OCT在医学诊断领域的主要应 用 OCT技术在眼科疾病、牙科疾病、心血管疾病、内 腔肠胃道疾病、皮肤癌的早期诊断以及胚胎发育生 物学等研究中，都具有重要的应用价值：眼科检查皮肤烧伤检查内腔活检眼科检查： 利用OCT技术，可用于眼底视网膜在微观解剖结 构上病变的检测，也可用于眼前部角膜、虹膜、 晶状体等组织的检测或参数测量。它是青光眼、 糖
11、尿病水肿等视网膜疾病早期诊断的有效工具。SLD 20nm FWHMUltra broad spectra enable micrometer resolutionFEMTOSOURCE 100 nm FWHM皮肤烧伤检查： 烧伤组织与正常组织的具有不同的光学各向异性特征，采用偏 振敏感的OCT成像，可以检测组织表层的烧伤程度。 内腔活检： OCT结合内窥镜，可以将检测范围拓宽到体腔内 部的呼吸道、消化道、泌尿系统以及心血管系统等 ，实施活体无损的高分辨率截面成像。心脏血管OCT还可以在制药、工业测量等领域中得到应用。感光性树脂时域OCT的成像原理1.以迈克尔逊干涉仪为核心，利用光源的低相干特性
12、，当参考臂和样品臂 的光程匹配时（光程差在一个相干长度范围内），才能产生干涉条纹 2.通过测量背向散射光来反映组织内部折射率的非连续性变化，干涉条纹 的幅度与背向散射光的强度成正比 3.深度分辨率 = 光源的相干长度 4.横向分辨率 = 聚焦光斑的大小 (1 10 microns) 5.探测深度: 对于高散射生物组织可以达到 1 3 mmOCT的空间分辨率时域光纤OCT光纤OCT的特点: 灵活性 可携带 易于集成到其他医学 成像仪器，例如：内 窥镜关键技术要点光学延迟线在光学领域应用广泛、类型繁多，在 OCT系统中应用的类型主要包括以下四种： 1. 利用反射器线性平移的光学延迟线； 2. 利用
13、旋转方法的光学延迟线； 3. 利用光纤拉伸的光学延迟线； 4. 基于频域光学脉冲整形技术的快速扫描光学延 迟线。可选择的宽带光源: (中心波长，谱宽，功率，稳定性，易用性) 1.连续光源: SLD/LED 2.脉冲光源: 钛锁模飞秒激光器 3.可调谐光源: AOTFn为克服微弱干涉信号给检测带来的难度，OCT 系统通常采用固定频移法来产生外差信号，实现 外差探测。 n光外差探测技术是一种高精度的测量技术，它 将包含有被测信息的相干调制光波和作为基准的 本机振荡光波，在满足波前匹配条件下在光电探 测器上进行光学混频。探测器响应的输出是频率 为二光波光频差的拍频信号，该信号包含有被调 制信号的振幅、频率和相位特征。 数据采集与处理在光电探测器输出电信号的处理上，要经过以下几个步骤： 首先要经过带通滤波器将直流和高频光强滤除，只允许外差调制信号通过； 然后再进行信号包络检测（解调：低通或锁相放大）； 最后利用高速数字采集系统将模拟电信号转换成数字信号，并传输到计算机 系统进行图像重建和显示。
