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1、基因操作技术的基本条件C 用于基因转移的受体菌或细胞B 用于基因克隆的载体A 用于核酸操作的工具酶看书找答案n1、核酸酶分哪两种，有什么差别？n2、限制性核酸内切酶分几种，哪种最常用，为什么？n3、DNA连接酶的作用是什么，哪两种较常用？n4、大肠杆菌DNA聚合酶的种类和作用n限制性内切酶主要用于DNA分子的特异切割 n核酸连接酶用于DNA和RNA的连接n核酸聚合酶用于DNA和RNA的合成 nDNA甲基化酶用于DNA分子的甲基化 n核酸酶用于DNA和RNA的非特异性切割 A 用于核酸操作的工具酶限制性核酸内切酶一、限制性核酸内切酶的发现及其生物功能1968年，Smith等人首先从流感嗜血杆菌d
2、株中分离出 Hind II和Hind III 一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。切开的是3，5磷酸二酯键。n核酸酶分为：外切核酸酶【从一头开始，顺序切断】内切核酸酶【能识别特定序列切断】n内切酶生理意义：分解外来DNA，保护自身DNA二、限制性核酸内切酶的类型及其主要特性特性1. 限制修饰活性2. 内切酶的蛋白 质结构3. 限制辅助因子4. 切割位点5. 特异性切割6. 基因克隆中I 型双功能的酶3种不同亚基ATP、Mg2+和S- 腺苷甲硫氨酸距特异性位点5 端至少1000bp不是（随机）无用II 型限制酶和修饰酶分开单一成分Mg2+位于识
3、别位点上是非常有用III 型双功能酶2种亚基ATP、Mg2+和S- 腺苷甲硫氨酸特异性位点3端 24-26bp处是用处不大限制性核酸内切酶三、限制性核酸内切酶的命名属名 种名 株名H i n d III H i n d IIIHaemophilus influenzae d 嗜血流感杆菌d株分离顺序：同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶四、影响限制性核酸内切酶活性的因素1、DNA样品的纯度：加大酶的用量，1 mg DNA 用 10U 酶加大反应总体积延长反应时间限制性核酸内切酶2、DNA样品的甲基化程度：3、核酸内切酶的缓冲液性质与II型核酸内切酶有关的几个概念粘性末端
4、cohesive ends：指DNA分子在限制酶的作用之下形成的具有互补碱基的单链延伸末端结构，它们能够通过互补碱基间的配对而重新环化起来。平 末 端 Blunt end：在识别序列对称处同时切开DNA分子两条链，产生的平齐末端结构。则不易于重新环化。 带5P端的黏性末端带3OH 和5P端的平末端（一）DNA连接酶的发现 首个DNA连接酶(ligase)1967年，大肠杆菌 DNA连接酶，是大肠杆菌基因编码的 。1970年，发现了T4 DNA连接酶 ， 由大肠杆菌 T4噬菌体基因编码的。二、 DNA连接酶（二）常用的DNA连接酶E.coli DNA连接酶 ：连接具互补碱基黏性末端(最初研 究表
5、明），现在研究可连接平末端；需NAD+辅助因子 ，活性低，不常用。T4DNA连接酶：连接具互补碱基黏性末端和平末端，需ATP辅助因子，活性高，常用。（三）T4 DNA连接酶连接反应的条件影响连接效率的因素有：A. 温度（通常在4-15 ）B. ATP的浓度(10ML - 1 )C. 连接酶浓度（平端的连接比粘性末端的连接要困难得多，所需 的酶量也多，一般平末端大约需12U，黏性末端仅需 0.1U）D. 反应时间（通常连接过夜）E. 插入片段和载体片段的摩尔比（ 1151） 三、DNA聚合酶n催化合成DNA的酶n特点：不能自行从头合成DNA链，必须有一个 RNA引物n分类: 大肠杆菌DNA聚合酶
6、 T4DNA聚合酶 T7DNA聚合酶 Taq DNA聚合酶 反转录酶（一） E.coli DNA聚合酶1. E.coli 的DNA聚合酶系统Pol I 参与DNA修复：具35和53外切酶活性pol II 参与DNA修复：具35外切酶活性pol III 参与DNA复制：具35和53外切酶活性2. E.coli pol 的特点1）具两种外切酶活性和DNA聚合酶活性在蛋白酶作用下，该酶分裂成两个大小不同的片段，其大片段称为Klenow片段, 具35外切酶活性2） 聚合酶活性，53, 要求3-OH引物和模板DNA3） 外切酶活性 （二）T4 DNA聚合酶1. 特点：53聚合酶活性；35外切酶活性【对单
7、链DNA强 】2. 用途：制备高比活性探针（三） Taq DNA聚合酶1. 特点：分离自水生栖热菌，分子量为94,000，最适反 应温度75， 对95高温具良好稳定性，该酶不存 在35外切酶活性2. 用途主要用于DNA的体外扩增，经25次循环后才进入酶的反应稳定期，一个DNA 分子因而可被扩增4106倍四、其它DNA修饰酶n磷酸酶和T4多聚核苷酸激酶nDNA酶（ DNase I）nRNA酶（ RNase）n末端脱氧核苷酸转移酶（TDT）一、DNase I1. 特点：具内切酶活性，但无核苷酸序列特异型，产生5-P低 聚核苷酸; Ca2+ , Mg 2+ 或Ca2+ , Mn2+可使酶活达最大值2
8、. 用途1) 切口移位，制备DNA探针2) 制备RNA样品时除去DNA分子3) 基因突变时产生切口 ds-DNA结构: 切口, 缺口, 断口缺口(gap) 切口(nick) 断口(cut)3HO P53HO P5Mn2+存在时 Mg2+存在时 DNaseI 作用特点DNaseIHO P5 35 35 3DNaseI与 Pol I 的 切口移位Pol IRNasenRNase H作用于DNA-RNA杂交分子中的RNA链，用于cDNA文库建立时除去DNA链以便第二条链cDNA链的合成。核酸修饰酶末端脱氧核苷酰转移酶（TdT）TdT的基本特性：来自小牛胸腺不需要模板的DNA聚合酶，随机掺入dNTPs
9、5 p 3 HOOH 3 p 5 TdTMg2+ dATP5 p 3 HOAAAAAAAAAAAA OH 3 p 5 外源基因不易自己进入细胞 进入后不能自我复制二、什么是载体（二、什么是载体（vectorvector ）？）？携带外源目的基因； 进入宿主细胞； 进行扩增和表达的具有运载能力的DNA三、分类 克隆载体【扩增】；表达载体【表达外源基因】一、为什么要用载体？一、为什么要用载体？B 用于基因克隆的载体四、作为载体的四、作为载体的DNADNA分子必须具备条件：分子必须具备条件：1.有复制子，至少有一个复制原点，能自主复制 或整合到染色体DNA上随其复制而同步复制。 2.有1至多个克隆位
10、点，供外源DNA片段插入载体 DNA分子。 克隆位点【外源DNA进来的座位】 克隆位点就是限制酶的识别位点【方便剪开载体，和外源DNA粘到一起】 A、一个载体，一 种限制酶识别位 点只有一个B、位点都在非必 需区，剪开也不 影响载体本身的 复制。3.必须具有用于选择克隆子的标记基因（1）抗性标记基因：抗生素抗性、重金属抗性(Cur ，Znr )、代谢抗性(TK，抗除草剂基因)（2）营养标记基因:主要是参与氨基酸，核苷酸及其他必需营养物合成酶类的基因（3）生化标记基因(其表达产物可催化某些易检测的生化反应，如lacZ)常用的遗传标记基因1) 氨苄青霉素抗性基因（Ampr）2)四环素抗性基因（Te
11、tr）Ampr抗性基因编码一种-内酰胺酶，可特异地 切割Amp的-内酰胺环，从而使其失去杀菌能力五、载体的种类五、载体的种类根据来源可分为：质粒载体噬菌体载体大分子DNA克隆载体病毒载体（一）质粒载体大多是在天然松驰型质粒的基础上经人工改造拼接而成，是应用最广的载体。质粒质粒的基本特征质粒是能独立于寄主染色体而自主复制、并被稳定遗传的一类核酸分子质粒常见于原核细菌和真菌中绝大多数的质粒是DNA型的绝大多数的天然DNA质粒具有共价、封闭、环状的分子结构，即cccDNA质粒质粒的基本特征质粒的自主复制性质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为
12、两大复制类型严紧型复制控制的质粒松弛型复制控制的质粒质粒质粒的构建理由：天然存在的野生型质粒分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想等缺陷，不能满足克隆载体的要求目前实验室使用的大肠杆菌质粒大多是由少数野生型质粒构建的pSC101 四环素抗性标记基因 TetrColE1 大肠杆菌内毒素标记基因 E1常用的质粒载体 是通过DNA重组技术构建而成的。pUC18, pUC19理想质粒载体应具备特点： 1. 松驰型复制子复制子（replicon）是质粒自我增殖所必需2. 几个单一的酶切位点（或多克隆位点）以便目的DNA片段插入一、质粒载体一、质粒载体3. 插入失活的筛选标记 一般应具有两种抗
13、菌素抗性标志 如氨苄青霉素抗性基因（Ampr）和四环素抗性基因（Tetr）等4.分子量相对较小和较高的拷贝数5.缺点：容量较小，一般只能接受小于15kb的DNA一、质粒载体(plasmid vector)（一） pBR322质粒载体（二） pUC质粒载体系列（一） pBR322质粒载体pBR322载体是最早被广泛应用克隆的载体之一，至今尚在使用。 pBR322载体的组成： 复制起始位点（ori） Ampr Tetr一、质粒载体p代表质粒; “BR”代表两位研究者 Bolivar和Rogigerus姓氏的字首； “322”是实验编号pBR322质粒载体和特点1. 带有一个复制起始点（ori） 2
14、. 抗生素抗性基因（Ampr和Tetr）作选择标记3. 数个单一的限制性酶切位点 当外源基因插入这些抗性位点时，就分别成为Amp敏感（Amps）或Tet敏感（Tets），即插入失活一、质粒载体4. 较小的分子量 易于自身DNA的纯化，而且能有效地克隆6kb大小的外源DNA片段。5. 较高的拷贝数经氯霉素扩增后，每个细胞达10003000个拷贝。一、质粒载体rrpBR332质粒结构示意图（二） pUC质粒载体系列 n在pBR322基础上改建而成一、质粒载体典型的pUC质粒载体有4个组成部分： 来自pBR322 质粒的复制起始点 Ampr基因 大肠杆菌-半乳糖苷酶基因（LacZ）的启动子及其编码-
15、肽链的DNA序列，称为LacZ基因 位于LacZ基因中靠近5-端的一段多克隆位点区段，但并未破坏该基因的功能pUC系列的优越性最通用的大肠杆菌克隆载体之一优点 具有更小的分子量和更高的拷贝数 构建pUC系列时仅保留了pBR322的复制子和 Ampr 具有来自大肠杆菌LacZ操纵子的LacZ基因， 适应于组织化学筛选重组体 一、质粒载体rpUC18/pUC19质粒载体结构病毒基本结构：DNA（或RNA）+ 外壳蛋白感染细菌的病毒，称为噬菌体。分类（根据病毒与宿主的关系）： 温和性病毒： 溶原性增殖构建病毒载体 烈性病毒： 溶菌性增殖改造后二、噬菌体和病毒载体噬菌体或病毒DNA大肠杆菌的 l 噬菌体DNAl 噬菌体的生物学特性： 生物结构l 噬菌体常指大肠杆菌的温和型噬菌体l 噬菌体由外壳包装蛋白和l-DNA组成 l-DNA全长48502个bpCOS区: 噬菌体两端存在 的12bp的互补序列.噬菌体或病毒DNA大肠杆菌的 l 噬菌体DNAl 噬菌体生物学特性： 感染周期E.coli吸附LamB受体注入复制包装裂解噬菌体或病毒DNA大肠杆菌的 l 噬菌体DNAl-DNA载体的构建：缩短长度缩短野生型l-DNA的长度，可以提高装载量。 根据切除的多少，可将l-DNA分成两大类载体
