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1、免疫荧光组化技术主要内容一、荧光的特征二、荧光素三、荧光素标记抗体的方法四、荧光抗体的质量鉴定五、免疫荧光组化染色方法六、荧光显微镜七、非特异性荧光的消除方法思考题：1.什么叫荧光？2.常用荧光素有哪些特征？3.标记荧光抗体有哪二种主要的制备方法？4.免疫荧光组化直接法、间接法的原理和主要操作流程？5.观察荧光组化片时应注意哪些问题？6.非特异性荧光的消除方法有哪几种？一、荧光的特征分子都含有电子，电子在不停地运动着。根据量子理论，运动着的电子可以处于一系列不连续的能量状态中，电子遵守一定的规则，要以从一个能级向另一能级跃迁，并伴随着与能级差相对应的特定能量的吸收或释放。激发 当电子吸收能量跃
2、迁到较高能级，这个过程叫激发。发射 以辐身方式跃迁时，能量转化成相应波长的光，这个过程叫发射。荧光 跃迁到激发态的电子，大多处于单重激发态。如果电子直接从单重激发态以辐身方式跃迁到基态，由于单重激发态很不稳定，半衰期很短，发射持续的时间也很短，这种发射光，叫荧光。二、荧光素能够产生荧光并能作为染料的化合物称为荧光色素，必须具备：吸收激发光的光能并发射荧光。1、具备用于标记抗体的荧光素条件(1)应具有与蛋白质分子形成共价键的化学基团，结合后不易离解，而未结合的色素及其降解产物易排除。(2)荧光效率高，与蛋白质结合后荧光素质量下降不多。(3)标记后对抗体的免疫学性质和生化性质无影响。(4)结合方法
3、简便而快速，并且较稳定。(5)荧光素容易溶解，溶解后不会和其 他物质发生化学反应。(6)荧光颜色与背景组织的自发荧光颜色对比鲜明，能清晰判断结果。2.荧光素的种类(1)异硫氰酸荧光黄（FITC）：分子量390D，最大吸收光谱为490495nm，最大发射光谱为520530nm。呈现明亮的黄绿色荧光，分子量389.4。(2)四甲基异硫氰酸罗达明（TRITC）是罗达明的衍生物，易溶于水，最大吸收光谱为550nm，最大发射光谱为620nm，呈橙红色荧光。(3)四乙基罗达明(RB200) 呈褐红色粉末状，溶于乙醇和丙酮，性质稳定，可长期保存。最大吸收光谱570nm，最大发射光谱596600nm，呈明亮橙
4、红色荧光，分子量580，RB200不能直接和蛋白质结合，要先经五氯化磷反应，转化成硫酰氯，再与蛋白质的氨基结合。(4)1-二甲基氨基-5-硫酰氯(5)4-乙酰胺-4-异硫氰酸-2-硫酸芪（SITS）(6)得克萨斯红（Texas red）(7)藻红蛋白（PE）(8)花青（Cyanine,Cy2,Cy3,Cy5）三、荧光素标记抗体的方法(一)FITC标记抗体的方法1.Marsshall法(1)原理：当FITC在碱性溶液中与抗体反应时，主要是抗体分子上的赖氨酸 -氨基与FITC上硫碳胺键结合，一个IgG分子中有86个赖氨酸残基，一般最多能结合1520个。荧光素FITC-NC N-蛋白质 S H H
5、FITC- N C N - 蛋白质 H S H(2)操作流程抗体与荧光素比例为50-100:1抗体的准备：20mg/ml，碳酸盐缓冲液为总量的1/10。荧光素的准备：用分析天平准确称取0.01mgFITC/1mg抗体。结合：边搅拌边将称取的荧光素加入抗体溶液中。透析过柱 SephadexG50或 G25保存 4 ,-40等量甘油分装保存。2.Chadwick法3.改良法4.透析标记法（二）四乙基罗达明标记抗体方法（三）藻红蛋白标记抗体方法四、荧光抗体的质量控制主要进行特异性和敏感性两个方面的鉴定。1.特异性染色效价测定2.非特异性染色测定3.吸收试验4.F/P比值的测定方法五、免疫荧光组织化学
6、染色方法 1.直接法 简便、快速，用已知特异性标记荧光的一抗与组织细胞内抗原结合。操作流程：(1)冰冻切片经固定，凉干PBS洗；石蜡切片脱蜡至水，消化30min，PBS洗。(2)适当稀释荧光抗体滴加在组织切片上，湿盒内37温育1h，PBS洗33min。(3)0.01%伊文氏蓝衬染13min，PBS洗33min，蒸馏水洗2次，除去Nacl结晶。(4)pH9.0缓冲甘油封片。(5)镜检2.间接法 是直接法的重要改进，先用标记的已知特异性一抗与组织细胞内抗原结合，随后用间接荧光标记二抗与一抗特异性结合。操作流程 (1)冰冻切片经固定，凉干后PBS洗；石蜡切片脱蜡至水，PBS洗，酶消化，PBS洗33m
7、in。(2)适当稀释特异性一抗，37孵育1h，或室温4h，或4过夜，PBS洗33min。(3)荧光标记二抗适当稀释37 30min，PBS洗33min。(4)0.01%伊文氏蓝衬染13min，PBS洗33min。(5)封片，镜检。六、荧光显微镜检查方法1.荧光显微镜 荧光显微镜是免疫荧光组织化学的基本工具。它是由超高压光源，滤片系统(包括激发和压制滤板)，光学系统和摄影系统等主要部件组成，是利用一定波长的光激发标本发射荧光。(1)光源 光源的亮度应根据荧光素的类型选择。小功率汞灯可满足激励一般荧光染料的要求。对于免疫荧光染色需用大功率超高压汞灯。其工作时，两个电极间放电，引起球内水银蒸发，经过
8、515min，球内气压升至5070标准大气压，此时达到最高亮度，成为稳定工作状态。(2)滤片系统 是荧光显微镜的重要组成部分，是获得特定波长光，清晰的荧光影像和发挥显微镜最佳性能之关键。了解滤片性能，正确地选择滤片是观察荧光效应的前提和必要条件。滤片系统包括激发滤片，阻断滤片、隔热滤片，分光镜和其他一些中性滤片。荧光显微镜的滤片系统激励法分光镜镜激发滤发滤 光 片截止滤滤光 片用途UDM400BP330-385 BP360-370BA420自动荧动荧 光观观察法，DAPI(联脒联脒 基吲哚吲哚 )： DNA Hoechest 33358,33342染色体 VDM455BP400-410BA45
9、5儿茶酚胺观观察 BVDM455BP400-440BA475芥子喹吖喹吖 因；染色体 BP420-440硫磺素S：淋巴细细胞 吖吖淀黄素：核酸 BDM500BP450-480BA515异硫氰氰酸荧荧光素：荧荧光抗体观观察 BP470-490吖啶吖啶 橙：DNA，RNA BP420-480金胺结结核杆菌 IBDM505PB460-490BA515IF BP470-490 GDM570BP510-550BA590罗罗丹明 BP530-550四甲基罗罗丹明异硫氰氰酸盐盐：荧荧光抗体观观察 BP480-550碘化丙啶啶：DNA IGDM565BP520-550BA580IF DM600BP545-58
10、0BA610IF德克萨萨斯红红：荧荧光抗体观观察HybridizeDenatureProbe DNASample DNAWash& DetectFluorescent In Situ HybridizationIndirect LabelDirect LabelHow does fluorescence microscopy work?Dichroic MirrorWavelengthIntensityFluorescent Light Source 100W MercuryWavelengthIntensityWavelengthIntensityExcitation Filter Sing
11、le Band Pass Dual,Triple,QuadEmission Filter Single or Multi Band PassEpi-Fluorescent DetectionBrightfieldF.I.S.H.Why use an imaging system? Samples fade so an immediate permanent record can be very useful. Cameras can pick up more information than the human eye. E.g. infra red light. Speed & Flexib
12、ility. Full Automization. Documentation.Golden Rules of Fluorescent Microscopy Ensure that filters are optimised for fluorochromes used. Treat filters with great care. Ensure an adequate, full spectrum, light supply. If possible use an imaging system.2.标本制作要求(1)载玻片厚度应在0.61.2mm之间(2)盖玻片应光洁，厚度在0.17mm左右
13、(3)标本不能太厚，如太厚激发光大部分消耗在标本下部，而物镜直接观察到的上部不能充分激分。(4)封片剂 常用甘油，必须无自发荧光，无色透明，荧光的亮度在pH8.59.5时较亮，不易很快褪去。甘油和0.5mol/L pH9.09.5的碳酸盐缓冲液等量混合作封片剂。荧光信号增强封片剂mowiol 40-88 4.8g甘油 12ml蒸馏水 12ml0.2mol/L Tris(pH8.5) 24ml上述混合（加热溶解），5000g离心，15min，最后加入1.4-diazobicydo-2,2,2-octane(DABcos)，终浓度2.5%(约1.25g)，溶解后，分装存于-20中。(5)镜油3.使
14、用荧光显微镜注意事项(1)严格按说明书操作，不要随意改变程序。(2)应在暗室中进行检查。(3)防止紫外线对眼睛的损害。在调整光源时应戴上防护眼镜。(4)检查时间每次以12h为宜，超过90min，超高压汞灯强度逐渐下降，荧光减弱。(5)荧光显微镜光源寿命有限，标本应集中检查，以节省时间，保护光源。光源关闭后必须在30min后才能再启动光源，一天中应避免数次点燃光源。(6)标本染色后应立即观察。(7)荧光高度的判断标准，分四级“ ”为阴性，“ ”为仅能见明确可见的荧光；“ ”为可见有明亮的荧光；“ ”为可见耀眼的荧光。七、非特异性染色的消除方法 根据产生的原因采取适当的方法，常用方法 ：1.动物脏
15、器粉末吸收法2.透析法3.Sephadex G-50柱层析法4.DEAE纤维素柱层析法5.荧光抗体稀释法6.纯化抗原方法7.纯化抗体方法8.伊文氏蓝衬染方法：0.01%伊文氏蓝八、激光扫描共聚焦显微镜激光扫描共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscope,LSCM)是80年代发展起来的一项具有划时代意义的高科技新产品。实现了对细胞内部非侵入式光学断层扫描成像，从而对被检物体样品从停留到表面单层，静态平面的观察进行到立体，断层扫描、动态全面的观察，在生命科学研究中得到迅速应用。1.仪器构成 (1)计算机系统：控制着机械，光学、声学系统及各种外围设备。(2)激光
16、照射系统：氩离子激光器和声光调节器。(3)显微镜系统，它主要由倒置显微镜和共聚焦系统组成。(4)检测系统，由检测器，检测放大器等元件组成。(5)XY平台 (6)Z-轴步进马达2.共聚焦成像原理激光器发出的激光束经过光的扩束和整形，变成一束直径较大的平行光束，长通分色光镜使光束偏转90度，经过物镜会聚在物镜的焦点上，样品中的荧光物质在激光的激发下发出沿各个方向的荧光，一部分荧光经过物镜，长通分色反射镜，聚焦透镜，会聚在聚焦透镜的焦点外，经过焦点处的针孔，由检测器接收并转变成电信号。3.光信号接收和成像方式(1)光信号接收 生物样品发出的荧光通常有二种接收方式：由光电倍增管（PMT）把光信号转变成电信号；利用电荷耦合器（CCD）把光信号转变成电信号。(2)成像方式 载物台运动成像：以直径
