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1、氨基酸的纸上层析 一、实验目的1、学习用纸上层析法进行分离和鉴定氨基酸。2、掌握氨基酸纸上层析法的实验操作技术。 返 回 最 近 观 看ppt回到主目录合 成 目 录二、实验原理层析法又称色层分离法，是分配层析中的一种。分配 层析是利用不同的物质在两个互不相溶的溶剂中的分 配系数不同而得到分离的。 纸层析是以纸作为惰性支持物的分配层析，纸纤 维上的OH具有亲水性，因此能吸附一层水作为固定 相，而通常把有机溶剂作为流动相。流动相流经支持 物（滤纸）时与固定相之间连续抽提，使物质在两相 之间不断分配而得到分离。 返 回 最 近 观 看ppt回到主目录合 成 目 录纸上层析的实际操作是在滤纸的一端点
2、上样品，干 后，在密闭的容器内，待纸饱和了适当的溶剂蒸汽后， 令溶剂从样品的一端经过毛细管的作用，流向另一端， 使样品中的混合物得到分离（如下图示）。 层析点点样处单向层析层析返 回 最 近 观 看ppt回到主目录合 成 目 录各成分被分开后， 在滤纸上的实际位置可 借喷涂适当的显色剂使 其显色，这样就可以获 得层析图谱。物质分离后，层析点在图谱上的位置，即在纸 上的移动速率，用Rf（比移值）表示。层析点原 点溶剂前 沿层析图谱示意图 返 回 最 近 观 看ppt回到主目录合 成 目 录三、实验用仪器和试剂1、仪器和材料：烧杯（800ml）、层析滤纸（新华1#）1811cm、毛细滴管、竹镊子
3、、喷雾器、刻度尺、铅笔、烘箱、针线、电吹风、表面皿2、试剂：（1）将下列氨基酸配制成1mg/mL的水溶液缬氨酸、组氨酸、谷氨酸、亮氨酸、甘氨酸（2）组氨酸、谷氨酸、亮氨酸的混合物：取上述已配好的三个标准氨基 酸溶液各10mL，混合均匀。（3）缬氨酸、甘氨酸的混合物：取上述已配好的二个标准氨基酸溶液各 10mL混合均匀。（4）展开剂（需新鲜配制）：正丁醇：甲酸：水 = 15：3：2（V/V）。（5）显色剂：0.1%茚三酮乙醇溶液。 返 回 最 近 观 看ppt回到主目录合 成 目 录1、准备滤纸：纸色谱所用滤纸与普通滤纸不同，两 面要比较均匀，不含杂质。通常选用杭 州新华1号层析滤纸，大小可根据
4、需要 自由选择。一般上行法所用滤纸的长度 为2030cm，宽度视样品个数而定。戴上橡胶手套，将滤纸裁剪成 18cm11cm，沿18cm的一边，在距纸 边缘2cm处，用铅笔轻轻划一条线，在 此线上每隔2cm画一小圆圈作为点样处 ，圈直径不超过0.5cm。 示意图四、实验步骤返 回 最 近 观 看ppt回到主目录合 成 目 录2、点样：氨基酸的点样量以每种氨基酸含520ug为宜，将准备 好的滤纸用竹镊子夹住，用毛细滴管在各小圆圈上依次点 上七种氨基酸样品溶液1，样品量约1020uml，点子不 宜过大，点子的扩散直径控制在0.5cm之内。如果样品溶 液过稀，可以在样品干燥后重复点样，必要时可反复数次
5、 2。用电吹风将斑点吹干，将点好样品的滤纸两侧比齐， 用线缝好，揉成筒状。注意缝线处纸的两边不要接触。避 免由于毛细管现象使溶剂沿两边移动特别快而造成溶剂前 沿不齐，影响Rf值。 返 回 最 近 观 看ppt回到主目录合 成 目 录3、展层：把已卷成筒状的滤纸放入烧杯中，用长颈玻璃漏斗从烧杯底部加 入20mL展开剂，注意不能把展开剂倒在滤纸上。溶剂（展开剂）必 须在点子以下，用表面皿盖住烧杯，记录时间，展开大约40min，当 溶剂走到滤纸上端3时，取出滤纸，并用铅笔标明溶剂前沿，然后 把滤纸放在一个表面皿上，再放入烘箱中，保持在105干燥，直到 酸味被赶走为止，大约15min。4、显色：用0.
6、1%茚三酮乙醇溶液均匀喷射已除去溶剂的层析滤纸的 一面，待其自然干燥后，放入65烘箱（鼓风烘箱）中干燥约5min ，被分离的氨基酸则显出色点来。取出滤纸，用铅笔轻轻描出显色 斑点的形状。5、计计算氨基酸的Rf值值：量出各斑点移动动的距离和溶剂剂移动动的距离，计计算每个氨基酸的 Rf值值。 回到主目录合 成 目 录注泽1注意点样的次序不要混淆。2点样过程中必须在第一滴样品干后再点第二滴，为使样品加速干 燥，可用电吹风加热干燥，但要注意温度不可过高，以免破坏氨基酸 ，影响定量结果。3即溶剂展层至距离纸的上沿约1cm时，注意不能使溶剂走过头。五、实验讨论与思考题1为什么在展层时有时用一种溶剂系统，而有时用两种溶剂系统 ？2酸性溶剂系统（或碱性溶剂系统）对氨基酸极性基团的解离有 何影响？ 返回 回到主目录合 成 目 录
