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1、 第四章 细胞工程Cell Engineering主讲教师主讲教师 魏琴魏琴 教授教授主要讲授内容：1 细胞工程概述2 植物细胞工程3 动物细胞工程4 微生物细胞工程本章要求： 理解细胞工程的概念； 掌握植物组织培养的基本原理和方法； 理解植物非试管快繁的基本原理和方法； 理解植物细胞培养、人工种子、细胞融合的基本原理和方法； 了解植物细胞工程的研究进展与应用前景； 理解单克隆抗体技术、细胞核移植与动物克隆、染色体转移、干细胞等研究的基本原理与方法； 了解动物细胞工程的研究进展与应用； 了解微生物细胞工程的基本原理； 了解微生物细胞工程的研究进展与应用。1 细胞工程概述作为生物工程重要分支的细
2、胞工程，近年来获得了令人瞩目的迅速发展。这不仅是由于它在理论上具有重要的意义，而且在工农业生产方面也具有广泛的应用前景。1.1 细胞工程概念 细胞工程：在细胞水平上研究、开发、利用各类细胞的工程，即人们根据科学设计改变细胞的遗传基础，并通过无菌操作，大量培养细胞、组织乃至完整个体的技术（教材P60）。 细胞工程：应用细胞学的方法，按照我们人类的需要和预定的设计，有目的、有计划地保存、改变和创造新细胞及其遗传物质，从而产生新的种或者品种的技术。 细胞工程：应用细胞生物学和分子生物学的方法，在细胞水平进行的遗传操作。 1 1 细胞工程概述细胞工程概述细胞工程：是指以细胞为基本单位进行培养、增殖（细
3、胞培养组织培养）或按照人们的意愿改造细胞的某些生物学特性，从而创造新的生物和物种，以获得具有经济价值的生物产品。它主要由两部分构成，其一是上游工程，包含细胞培养、细胞遗传操作和细胞保藏三个步骤。另一个则是下游工程，是将已转化的细胞应用到生产实践中去，以生产生物产品的过程。1.1 1.1 细胞工程细胞工程 概念概念1.2 细胞工程研究的对象细胞或其组成部分和构成的组织、器官等如染色体、细胞核、原生质体、整个细胞、受精卵、胚胎、组织或器官。1 1 细胞工程概述细胞工程概述1.3 细胞工程研究主要内容 细胞与组织培养：细胞、组织和器官培养三层次 细胞融合：单克隆抗体 染色体工程：染色体的添加、消减、
4、替换 胚胎工程：胚胎分割、胚胎融合、核移植、体外受精、性别鉴定、胚胎冷冻 细胞遗传工程：克隆、转基因技术1 1 细胞工程概述细胞工程概述1.4 细胞工程的优点1.4.1 细胞工程开辟了基因重组的新途径，它不需要经过分离、提纯、剪切、拼接等基因操作只需将细胞遗传物质直接转移到受体细胞中，就能够形成杂交细胞，因而提高了基因转移的效率。 1 1 细胞工程概述细胞工程概述1.4.2 细胞工程克服了常规杂交的局限性，使远缘杂交有了新的途径。它不仅可以在植物一植物之间，动物与动物之间，微生物与微生物之间进行远缘杂交，甚至可以在动物与植物、动物与微生物之间进行细胞融合，形成杂交物种。土豆番茄、山绵羊、大豆烟
5、草、芹菜胡萝卜 。1.4.3 用细胞工程的技术来改造和创造新生物，比起用基因工程技术来稍为容易些 。1.4 1.4 细胞工程细胞工程 的优点的优点1.5 细胞工程与其他生物工程的关系细胞工程与其他生物工程的关系1 1 细胞工程概述细胞工程概述1.6 细胞工程的应用细胞工程作为科学研究的一种手段，已经渗入到生物工程的各个方面，成为必不可少的配套技术。在农林、园艺和医学等领域中，细胞工程正在为人类做出巨大的贡献。1 1 细胞工程概述细胞工程概述优质植物快速培育与繁殖动物胚胎工程快速繁殖优良、濒危品种利用动植物细胞培育生产活性产物、药品新型动植物品种的培育供医学器官修复或移植的组织工程转基因动植物的
6、生物反应器工程珍稀动植物资源的保存与保护在遗传学发育学等领域的理论研究在能源、环境保护等领域的应用1.6 1.6 细胞工程的细胞工程的 应用应用2 植物细胞工程2.1 植物组织培养 2.2 植物细胞培养 2.3 植物非试管快繁 2.4 植物原生质体培养与融合 2.5 人工种子的研制 2.6 植物细胞工程研究进展（综述）2.1 植物组织培养（Plant tissue culture）2.1.1 几个重要概念2.1.2 对植物组织培养实验室的要求2.1.3 植物组织培养的步骤2.1.4 主要植物组织培养技术2 2 植物细植物细 胞工程胞工程2.1.1 几个重要概念 植物细胞全能性（Cell Tot
7、ipotency）：指任何具有完整的细胞核的植物细胞（不管性细胞还是体细胞），都拥有形成一个完整植株所必需的全部遗传信息，在特定的环境下能进行表达，产生一个独立完整的个体。满足两个条件:离体;给予适当的刺激经历两个过程:脱分化;再分化2.1 2.1 植物组植物组织培养织培养脱分化 再分化 外植体 愈伤组织 生长点幼茎、根 小植株 植物组织培养：在 无菌条件下，将离体的植物器官（根尖、茎尖、叶、花、果实、种子等）、组织（花药、胚乳、皮层、髓组 织等）、细胞（体细胞、生殖细胞等）、胚胎（成熟或 未成熟的胚）、原生质体等培养在人工配制的培养基上 ，给予适当的培养条件，诱发产生愈伤组织、丛生芽或 长成
8、新的完整的植株的一种实验技术。由于在试管内培 养，且培养的是脱离植株母体的培养物，所以也叫“离 体培养” （Culture in vitro）或“试管培养” （In test-tube culture） 。2.1.1 2.1.1 几个重几个重 要概念要概念外植体(Explant)：植物组织培养中用来进行离体无菌培养的离体材料，可以是器官、组织、细胞和原生质体等。愈伤组织(Callus)：外植体产生的排列疏松而无规则且没有发生分化的薄壁细胞。 脱分化（dedifferentiation）：原来已经分化,并且具有一定功能的体细胞(或性细胞),丧失了原有的结构和功能,又重新恢复了分裂功能,就叫做植物
9、细胞的脱分化。 2.1.1 2.1.1 几个几个 重要概念重要概念2.1. 2 对植物组织培养实验室的要求化学实验室或培养基配制室洗涤室或消煮室菌室或接种室培养室观察与鉴定室温室或苗圃 贮存室接种室培养室2.1. 2 2.1. 2 对植物组织培对植物组织培 养养实验室的要求实验室的要求观察与鉴定室大棚2.1. 2 2.1. 2 对植物组织培养对植物组织培养实验室的要求实验室的要求2.1.3 植物组织培养的步骤(http:/ 培养基配制 2.1.3.2 灭菌 2.1.3.3 接种 2.1.3.4 培养 2.1.3.5 试管苗驯化移栽 2.1.3.6 试管苗增殖率的估算 2.1.3.7 快速繁殖工
10、作的计划安排 2.1 2.1 植物组植物组织培养织培养2.1.3.1 培养基（Culture medium ）的配制一个完善的培养基成分： 无机营养成分大量元素：浓度大于0.5毫摩尔/升；包括H、O、N、P、K、Ca、Mg、S等元素（配成母液 ）微量元素：其浓度小于0.5毫摩尔/升；微量元素包括Cu、Mo、Zn、Na、Mn、Co B和I等（配成母液 ）铁盐 采用硫酸亚铁和乙二胺四乙酸二钠结合成螯合铁配置而成（配成母液 ）2.1.3 2.1.3 植物组植物组 织培养织培养的步骤的步骤 有机营养成分：（配成母液 ） 碳水化合物：蔗糖和葡萄糖，白糖节约成本一般的使用浓度为2%4%。 植物生长调节物质
11、（常称为激素）：配成母液 生长素：NAA、IAA、IBA、 2，4D；细胞分裂素：KT(激动素)、6-BA(6-苄基腺嘌呤)、ZT（玉米素）、2iP（2异戊烯腺嘌呤）、4PU、CPPU（吡效隆）和TDZ（噻重氮苯基脲）。其它：赤霉素（GA3 ）；脱落酸（ABA）；多效唑 （PP333 ） 水：一个完善的一个完善的 培养基成分培养基成分培养基的种类： 按培养基组成特点分类第一类为含盐量高的培养基，如MS、LS、BL、ER。第二类为硝酸钾含量高的培养基，如B5、N6、SH。第三类是无机盐中等含量培养基，如H和Nitsch培养基。第四类为低盐含量基本培养基，如White、WS和HE培养基。 按培养基
12、的功能分类脱分化培养基 初代培养基分化培养基壮苗培养基 生根培养基 继代培养基.1.3.1 .1.3.1 培养基培养基 的配制的配制外植体愈伤组织（脱分化培养基）丛生芽（再分化培养基） 再生根（生根培养基）再分化脱分化壮苗（壮苗培养基）接种2.1.3.1 2.1.3.1 培养基培养基 的配制的配制怎样选取最佳培养基方案（例：MS+6BA0.5mg/L+NAA1mg/L+Su3%+Agar0.6%）对于某个待培养的目的植物来讲：查资料-预备性试验-观察培养物的反映-调整：单因子试验，多因子试验和正交设计-逐步添加和逐步排除 基本培养基的选择 激素的选择：激素种类、浓度、激素配比 糖的选择：糖的种
13、类、浓度的选择 琼脂的选择：主要是浓度的选择 附加物的选择：香蕉汁、活性炭、椰子汁等浓度为mg/L细胞分裂素 0.5 1.5 34.5生 长 素0 （1） （2）（3）（4）0.5 （5）（6）（7）（8）1.0 （9） （10） （11） （12）1.5（13） （14） （15） （16） 培养基的配制方法（药品室进行）MS+6-BA0.5+NAA1+Su3%+Agar0.6% 500 mL 水+母液： 激素或其他成分：如活性碳等 糖类：一般30g/L 琼脂 ：一般68g/L 加热溶化： pH值调整： 定容： 分注、封口： 灭菌 ：2.1.3.1 2.1.3.1 培养基培养基 的配制的配制
14、2.1.3.2 灭菌湿热灭菌：培养基及布制品的灭菌 几种排气的方法： 时间与体积的关系： 放气方法：容器的体积/mL在121灭菌所 需最少时间 /min20-501575-15020250-500251000302.1.3 2.1.3 植物组织植物组织 培养的步骤培养的步骤灼烧灭菌：用于无菌操作的器械95%的酒精 +酒精灯火焰上灼烧接种器杀菌器：如图过滤灭菌：不耐热的物质2.1.3.2 2.1.3.2 灭菌灭菌干热灭菌：玻璃器皿及耐热用具等紫外线和熏蒸灭菌：空间灭菌所用（培养室、接种室等）一些物体表面用药剂喷雾灭菌 2.1.3.2 2.1.3.2 灭菌灭菌消毒剂表面灭菌：植物材料（超净工作台上
15、，接种室）消毒剂因素材料采集的因素老嫩因素部位因素天气因素季节因素时间因素外植体消毒步骤2.1.3.2 2.1.3.2 灭菌灭菌消毒剂因素 消毒剂剂使用浓浓度去除难难易消毒时间时间 （分）效 果次氯氯酸钙钙910易530很好次氯氯酸钠钠2易530很好过过氧化氢氢1012最易515好溴 水12易210很好硝酸银银1较难较难530好氯氯化汞0.11较难较难225 最好抗生素450mg/L中3060较较好酒 精7075易数秒5分好漂白粉饱饱 和易530很好2.1.3.2 2.1.3.2 灭菌灭菌外植体消毒步骤 材料自来水蒸馏水75%酒精3060 S 无菌水34次10%次氯酸钠或次氯酸钙饱和液或0.10.2%升汞 （吐温）515 min 无菌水洗58次。2.1.3.2 2.1.3.2 灭菌灭菌.1.3. 接
