《固氮酶的功能与结构》由会员分享，可在线阅读，更多相关《固氮酶的功能与结构（5页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、固氮酶的功能与结构1 生物固氮研究背景氮素是一种植物必需的大量元素，是蛋白质、核酸和磷脂的重要组成成分。为了满足高产农作物对氮素的营养需求，人们需要经常给农作物施用氮肥。据统计数据推测，至21 世纪 30 年代，至少还要再建100 座年产 30 万 t 的尿素厂来生产氮肥以满足市场需求。 氮肥的施用虽然增加了粮食产量，但同时也增加了农业生产成本，并带来了许多生态问题 （化石能源的消耗、大气污染和水体污染等） 。因此人们希望用比较环保的生物手段来代替现在的化学手段，以满足农作物的氮素需求。生物固氮现象作为另一个为农作物提供氮素的途径，克服了化学氮肥的缺点，并且其固氮量约占全部自然界和工业合成总量
2、的60%左右1。因此如何利用生物固氮为农作物提供氮素已成为人们关注的焦点。生物固氮由固氮酶来催化完成，因此研究固氮酶对于生物固氮在农业生产中的应用非常重要。固氮酶的结构、催化机制、 活性调节和基因表达等是当前的研究重点。各种固氮生物无论是共生的根瘤菌、弗兰克氏菌（放线菌）与满江红鱼腥藻，还是自生、联合固氮细菌、蓝藻和光合固氮细菌， 它们之所以能将空气中分子态氨素在常温常压下固定下来，转化成可供有机体利用的化合态的氨，都是通过其体内的一种具有催化功能的蛋白质固氮酶来完成的。因此，探索固氮酶的结构及其作用的机理，就始终是生物固氮研究中的热点。它的阐明，不仅可以提高固氮生物的固氮能力，为农业生产开辟
3、肥源， 而且也为人工模拟固氮的活动。 在温和条件下还原分子氮，使工业合成氨的催化剂起一个革命性变化2。2 固氮酶的结构一般而言，固氮酶是由钼铁蛋白（MoFe protein）和铁蛋白（ Fe protein）组成的。这 2 种蛋白只有形成复合体后， 固氮酶才具有催化氮转化成氨的活性，单独存在时无催化能力。 此外，近来的研宄还发现了第2、 3 套固氮酶系统的存在。第 2 套固氮酶系统由钒铁蛋白和铁蛋白2 组成，它在无钼含钒的介质中合成， 在无氧的条件下具有活性；而第3 套固氮酶系统则由铁铁蛋白和铁蛋白3 组成,因而在无钼无钒条件下一些固氮菌也能固氮，但酶活性很低3。图 1 固氮酶的结构2.1 铁
4、蛋白铁蛋白又被称为组分2 或固二氮酶还原酶（ Dinitrogenase reductase ） ，只含铁不含钼，是由 2 个相同亚基组成的 2 型二聚体，分子量为59-73 kD，因菌种不同而略有差异。每个亚基的结构均是1 个/结构域 ,其中含有 9 个螺旋和8 个折叠。每个二聚体中含4 个 Fe 和 4 个酸不稳定 S，组成一个 4Fe4S的原子簇。Georgiadis等对 A.vinelandii 铁蛋白的晶体结构分析得知， 它是一个轴对称的二聚体，对称轴从正中穿过 4Fe4S簇， 并沿着二聚体 2个亚基之间的界面伸展。2个亚基之间通过 4Fe4S簇桥联。 围绕在 4Fe4S簇周围还有大
5、量的疏水键和盐桥，以保证二聚体的稳定性。据测定，不同来源的铁蛋白的氨基酸序列的同源性为45%-90%，因而铁蛋白的基本结构是很保守的。尤其是 5 个半胱氨酸残基都处于保守区内，其中的 2 个半胱氨酸残基与4Fe4S簇配位， 对活性起主要作用。同时，所有铁蛋白都在第101 位（或 100位）处有 1 个精氨酸残基， 这些特征对铁蛋白的功能起决定性作用。在铁蛋白内还有2 个 MgATP 结合水解位点，一个在铁蛋白的 N-末端的第 9-16 位氨基酸处，此处是序列为甘氨酸-X-X-X-X- 甘-赖-丝/苏氨酸的 Walker A 肽段，另一个在第 125-128 位氨基酸处，它是 Walker B
6、肽段4。2.2 钼铁蛋白钼铁蛋白，又被称为组分1 或固二氮酶（ Dinitrogenase） ，是由 2 个亚基和 2 个亚基组成的四聚体，分子量为220 -245kD，其中 亚基约为 55kD，亚基约为 60kD。在二聚体中， 2 个亚基以轴对称的方式结合。每分子钼铁蛋白含有 2 个 Mo、24-32个 Fe和相应数目的酸不稳定S。这些金属原子大致有2 种状态，分别为 P 中心（或 P 簇）和 M 中心（或 M 簇） 。P簇约含有 16 个 Fe和相应数目的酸不稳定S， 由 2个 8Fe7S组成 （1个 4Fe4S和 1个 4Fe3S共用 4Fe4S的 1 个 S，或 1 个 4Fe4S和
7、1 个 4Fe3S通过 2 个半胱氨酸残基的S 与附近的 Fe桥联而成）。 每个二聚体中含 1 个 P 簇。 M 簇含有 2个 Mo、 14个 Fe和 16 -18个酸不稳定S，是铁钼辅因子（ FeMoco）非共价结合的前体。每个二聚体均含有 I 个 FeMoco（含 I 个 Mo、个 Fe和 8-9 个酸不稳定 S 和 1 个高柠檬酸分子） 。EiMle（2002）等在 I.16A 分辨率的条件下分析钼铁蛋白，发现在FeMoco中心存在 1 个先前未知的 6 个 Fe 的配体，且其内部有1 个轻的原子与6 个 Fe键连接（此轻原子不可能是S，最可能是 N，但不排除是 C 或 O 的可能） 。
8、在催化反应时， P 簇负责传递电子， FeMoco 则是固氮酶的活性中心。此外，FeMoco还是钼铁蛋白中特征电子顺磁共振（EPR）的信号来源5。钼铁蛋白中 和亚基的折叠方式相似， 每个亚基含有 3 个结构域，每个结构域之间有 1 个裂缝， FeMoco 位于亚基裂缝的底部，完全被亚基包围， P簇位于 二聚体的交界处，距钼铁蛋白表面约1.0nm，距 FeMoco 约 1.5nm。不同来源的钼铁蛋白的氨基酸序列有47%-66%相似，所以也具有较高的保守性，且其中半胱氨酸的位置通常是相同或相近的。钼铁蛋白亚基的 N 末端区的长度与同种铁蛋白的C 末端的长度具有对称关系5。钼铁蛋白的相关研宄己有半个
9、世纪的历史，但仍有新观点不断被提出。如Smith 提出了关于固氮酶中钼铁蛋白新的结构分析，揭示出在活性位点存在的缝隙原子可能是N，这个发现将帮助科学家设计出更有效的从大气中固氮的方法。再如，近来人们 NifEN 与将去除 M 簇的钼铁蛋白和完整的钼铁蛋白的结构进行比较，提出了簇插入相应的NifEN 和钼铁蛋白的相似途径6。2.3 钒铁蛋白钒铁蛋白的结构和特性与钼蛋白相似，除了 2 个和 2 个亚基之外，还有2 个很小的 亚基且含 2 个钒铁辅因子（ VFeco） 。此外，第 2 套固氮酶系统中的铁蛋白 4 与铁蛋白的氨基酸序列同源性达90%， 第 3 套固氮酶系统中的铁蛋白-3与铁蛋白的氨基酸
10、序列同源性有60%。3 固氮酶的催化机制固氮酶的催化机制为：氧化态的铁蛋白从还原态的电子供体如黄素还蛋白（Fld） 、铁氧还蛋白（ Fd）等接受 1 个电子，变成还原态的铁蛋白，2MgATP 与铁蛋白结合成铁蛋白 -2MgATP，再与钼铁蛋白结合， 形成复合体， 传递电子给钼铁，蛋白，同时伴随着ATP水解成 ADP 和 Pi，铁蛋白变为氧化态，铁蛋白和钼铁蛋白解离。如此循环2 次，传递 2 个电子，钼铁蛋白络合N2，并释放出 H2。再循环 6 次，传递 6 个电子，形成中间产物后，释放出NH3 ，整个过程共传递8 个电子。由 1 分子的 N2 转化成 2分子的 NH3 只需要 6 个电子，但由
11、于要将2个质子转化为 1 个 H2，所以共需 8 个电子7。图 2 固氮酶的催化反应示意图由此可见 ,在固氮反应中， 铁蛋白起电子传递的作用， 钼铁蛋白起络合 N2 并进行催化的作用，而MgATP 的作用是与铁蛋白结合，使铁蛋白构型发生变化，与钼铁蛋白形成复合体后，MgATP 水解，使电子从铁蛋白传递到钼铁蛋白。目前，人们对于钼铁蛋白中活化队的方式的观点不统一，己经提， 出了几十种模型8。相关的研究表明， 上述固氮反应中， 固氮酶中 ATP 的水解控制着铁蛋白和钼铁蛋白的分离与结合，并由此控制着N 元素的转化。在ATP 发生转化时，固氮酶复合物的构象会发生彻底的改变。 这些结构揭示了在钼铁蛋白
12、表面完全不同的活性中心位点， 它们依赖于铁蛋白上的核苷酸状态。此外，对 135 位上的苯丙氨酸被色氨酸取代的铁蛋白的晶体结构进行射线衍射分析发现，4Fe4S 簇附近的135 位上的苯丙氨酸与核苷酸诱导4Fe4S簇的改变有关。固氮酶不仅能将N 转化为铵态氮，还能使一氧化碳转化为乙烯、乙烷和丙烷。这 2 个反应间的类似性揭示了地球上C 循环和 N 循环之间在反应机制和进化上的联系。迄今为止，固氮酶的催化机制中尚存在如N2 的确切络合位点、质子的确切络合位点及 FeMoco 能络合 N 但不能还原 N2 的机理等许多问题有待于进一步研究。4 固氮酶的活性调节固氮生物体内， 固氮酶的活性调节是一个非常
13、复杂的问题，参予调节的因子很多，其中主要的有两种水平： 一是在基因水平上调节酶的合成和表达；二是固氮合成后， 在生理生化基础上的调节。 但这二者又不能截然分开。 无论是固氮酶的合成还是其活性都与氮调节（Ntr）系统及谷氨酰胺合成酶（ GS）-谷氨酸合成酶（GOGAT）系统（即 Gln 系统）密切相关。 它们形成了一个级联调节 （Cascade regulation） ，这还在具体的研究当中。参考文献1Newton WE.Nitrogenases:Distribution,composition,structure and function.In:New horizons Nitrogen Fi
14、xation.Palacios R Newton WE(eds).Kluwer Academic Public，1993:5-8 2 曾定固氮生物学.厦门大学出版社,1987 3 高阳光 ,周因庄 .钒固氮酶及其模型配合物J.化学通报 ,2007(4):270-276 4 王 友 邵 ,李 季 轮 .固 氮 酶 催 化 机 制 及 其 化 学 模 拟 生 物 固 氮 研 究 进 展 J. 自 然 科 学 进展,2000,10(6):481-487 5EINSLE O,TEZCAN F A,ANDRADE S L A,et al.Nitrogenase MoFe-Protein at 1.16A
15、 resolution:Acentral ligand in the FeMo-CofactorJ.Science,2002,297(5587):1696-1700 6Kaiser J T,HU Y,WG J A,et al.Structure of precursor-bound NifEN:A nitrogenase FeMo cofactor maturase/insertaseJ.Science,2011,331:91-94 7 李卫平 ,孙忠科 ,张文丽 ,等.小麦固氮作用研究进展J.麦类作物报 ,2006,26(6):162-165 8 周 朝 晖 , 严 文 斌 ,张 凤 章 , 等 . 固 氮 酶 催 化 作 用 机 理 及 化 学 模 拟 J. 厦 门 大 学 学报,2001,40(2):320-329
