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1、基因组DNA提取及鉴定1、0.1g 细胞 2ml epp，混匀。2、700l bufferA，65，10m，中间混匀一次3、苯酚350l，氯仿350l，混匀3m，12000rpm，5m4、上清500l 至1.5ml epp，500l（等体积）氯仿，混匀 3m，12000rpm，10m5、上清400l到1.5ml epp，异丙醇400l（0.7-1）， 12000rpm，2m，（掏出DNA，毛细管）6、沉淀用70%乙醇洗2次，每次3m7、自然凉干（10m），30lTE，充分溶解8、琼脂糖凝胶电泳鉴定蛋白质浓度测定方法比较 一、 实验目的学习三种蛋白质浓度的测定方法，并比 较优缺点。 二、 实验原
2、理与步骤OH 磷钼钼酸、磷钨钨酸 Pr+CuSO4 Pr-Cu络络合物（紫红红色）蓝蓝色化合物蛋白质测定的范围：25250g/mL 标准蛋白BSA 250g/mL 测定波长：660nm1、 Lowry法（Foling-酚法）反应原理：测测定步骤骤：标准蛋白BSA 250g/mL（1）依次向试试管中加入试剂试剂 ：（2）A660Pr作图，求待测蛋白浓度管号123456待测测1待测测1， BSA(mL)00.20.40.60.81.01.01.0D.W(mL)1.00.80.60.40.2000Pr(g/mL ) 试剂试剂 甲（mL ）5.0 室温反应应10分钟钟（双缩脲缩脲 反应应）试剂试剂 乙
3、（mL ）0.5 立即振摇摇，30水浴20分钟钟A660原理：蛋白质质分子中Tyr, Try, Phe的苯环环含有共轭轭双键键，因此蛋白质质具 有UV吸收的性质质，吸收高峰在280nm处处。测测定范围围：0.11mg/mLpr测测定波长长：280nm标标准蛋白BSA： 1mg/mL测测定步骤骤：（1）向各试试管中依次加入各种试剂试剂 ：（2）以A280nm-Pr作标标准曲线线，求待测蛋白浓度管号123456待测测1待测测1，BSA（mL）00.51.02.03.04.04.04.0 D.W(mL)4.03.53.02.01.0000Pr(mg/mL ) A280nm2、紫外线（UV）吸收法：3
4、、考马马斯亮蓝显蓝显 色法（Bradford法）实验实验 原理：PrCBBG-250-Pr复合物 A595标标准蛋白BSA： 250g/mL操作步骤骤：（1）依次向各试试管中加入各种试剂试剂 ：（2）以A595nm-Pr作标标准曲线线，求待测蛋白浓度管号123456待测测1待测测1， BSA（mL）00.20.40.60.81.01.01.0 D.W(mL)1.00.80.60.40.2000 Pr(g/mL) CBBG-250（mL）5.0 A595nm蔗糖酶km值的测定 一、实验目的：掌握sucrose酶的km测定的实验方法。二、实验原理：蔗糖酶是一种水解酶，催化反应：蔗糖+水G+F每水解
5、1molS，生成2mol还原糖，因此可用比色皿测定还原 糖量，即可知底物的水解速度。还原糖可还原3，5-二硝基水杨酸 （DNS）生成红棕色的氨基化合物，即3-氨基-5-硝基水杨酸。三、实验步骤 管号蔗糖 （ml）H2O （ml）123456780.50.7511.522.5344.54.2543.532.521 每管加酶液0.5 ml 37准确作用5 min NaOH 0.5 ml 每管取0.5ml DNS 0.5ml 沸水浴3min 冷却 DW 4ml A520取8只试管，按下表分别加入如下试剂： 以1/A5201/S作图，求Km四、Km测定的意义:1、酶的特征性常数，进行酶学研究必须测定的
6、一个参数；2、代谢研究（特别是分支代谢途径的调节），Km代表E争 夺S的能力，对反应速度（代谢）的计算非常重要。五、注意事项：1、底物浓度应选择在Km值附近；2、反应时间应尽可能短，以保证反应初速度；3、酶活力不能太高，否则不易控制；4、加样应为一个人操作，保证各管间隔一致。DNS-aa的聚酰胺薄膜层析 一、实验原理：荧光试剂二甲氨基萘磺酰氨（DNS-Cl）,能与氨基酸的N末 端结合生成荧光物质DNS-aa，DNS-Cl也可与多肽或蛋白质 的游离氨基结合，生成DNA-Pr或DNS-肽，经酸水解后释放 出DNS-aa，各种DNS-aa在聚酰胺薄膜的分配系数不一样 ，DNS-aa在360或280nm紫外光下发黄色荧光。二、实验步骤：1、取聚酰胺薄膜1张（一人一张），铅笔做上样点标记2、上样，毛细管上样直径2mm，多次上样3、展层（通风橱内）4、检测，用吹风机吹干，紫外光检测实验错开做，以避免仪器和试剂使用拥挤！DNA提取实验放在第一或第二个做分光光度计和水浴锅已调好，请不要调动波 长和温度，比色皿专用，请勿混用。实验报告
