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1、动物细胞培养及海水鱼类细胞系的建立秦启伟，黄晓红有害生物控制与资源利用国家重点实验室中山大学生命科学学院2第一部分第一部分（动物）细胞培养基本流程以及注意事项（动物）细胞培养基本流程以及注意事项3细胞培养细胞培养n n细胞培养细胞培养(cell culture) (cell culture) 的含的含 义，简单地说即是把来自机体义，简单地说即是把来自机体 的组织经分散成为单个细胞，的组织经分散成为单个细胞， 放在类似于体内的体外环境中放在类似于体内的体外环境中 生存，使其不断生长、繁殖或生存，使其不断生长、繁殖或 传代，借以观察细胞的生长、传代，借以观察细胞的生长、 繁殖、衰老等生命现象。细胞
2、繁殖、衰老等生命现象。细胞 培养技术在遗传学、免疫学、培养技术在遗传学、免疫学、 肿瘤学、病毒学、分子生物学肿瘤学、病毒学、分子生物学 等领域已得到广泛的应用。等领域已得到广泛的应用。n n4单个细胞单个细胞原代细胞原代细胞细胞株细胞株细胞系细胞系剪碎，胰蛋白酶剪碎，胰蛋白酶分离细胞分离细胞原代培养原代培养传代培养传代培养（遗传物质没有发生改变）（遗传物质没有发生改变）（遗传物质发生改变）（遗传物质发生改变）动物组织动物组织动物细胞培养基本流程动物细胞培养基本流程5细胞培养的材料准备1 细胞培养液2 胰酶消化液3 PBS缓冲洗涤液4 洁净无菌的细胞培养瓶、培养板6细胞培养基应用选择精要细胞培养
3、基应用选择精要n n选择培养基没有一定的标准，可供参考的几点建议：选择培养基没有一定的标准，可供参考的几点建议： n n(1(1）建立某种细胞株所用的培养基应该是培养这种细胞首选的培养）建立某种细胞株所用的培养基应该是培养这种细胞首选的培养基。可以查阅参考文献，或在购买细胞株时咨询。基。可以查阅参考文献，或在购买细胞株时咨询。 n n(2) (2) 其它实验室惯用的培养基不妨一试，许多培养基可以适合多种其它实验室惯用的培养基不妨一试，许多培养基可以适合多种细胞。细胞。 n n(3) (3) 根据细胞株的特点、实验的需要来选择培养基。如小鼠细胞株根据细胞株的特点、实验的需要来选择培养基。如小鼠细
4、胞株多选多选 RPMI1640 RPMI1640 。 n n(4) (4) 用多种培养基培养目的细胞，观察其生长状态，可以用生长曲用多种培养基培养目的细胞，观察其生长状态，可以用生长曲线、集落形成率等指标判断，根据实验结果选择最佳培养基，这是线、集落形成率等指标判断，根据实验结果选择最佳培养基，这是最客观的方法，但比较繁琐。最客观的方法，但比较繁琐。 7培养前准备在开始实验前要制定好实验计划和操作程序。有关数据的计算要事先做好。根据 实验要求，准备各种所需器材和物品放置操作场所(培养室、超净台)内消毒。这可以 避免开始实验后，因物品不全往返拿取而增加污染机会。培养室的消毒无菌培养室每天都要用0
5、.2%的新洁尔灭拖洗地面次(拖布要专用)，紫外线照射 消毒30-50min，超净工作台台面每次实验前要用75酒精擦洗。然后紫外线消毒 30min。些操作用具如移液器、废液缸、污物盒、试管架等用75%酒精擦洗后置 于台内同时紫外线消毒。洗手和着装原则上和外科手术相同。并于开始操作前要用75酒精消毒手和前臂。如果实验 过程中手触及可能污染的物品和出入培养室都要重新用消毒液洗手。进入原代培养 室需彻底洗手还要戴口罩、着消毒衣帽。培养过程中的无菌操作 在无菌环境进行培养或做其它无菌工作时，首先要点燃酒精灯。以后一切操作， 如按装吸管帽、打开或封闭瓶口等，都需在火焰近处并经过烧灼进行。进行培养时，动作要
6、准确敏捷，但又不必太快，以防空气流动，增加污染机会。不 能用手触及已消毒器皿，如已接触，要用火焰烧灼消毒或取备品更换。 8原代培养原代培养用直接从机体获得的细胞进行的培养称为原代用直接从机体获得的细胞进行的培养称为原代 培养培养 (Primary cell culture)(Primary cell culture)。这种培养过程主要是采用。这种培养过程主要是采用 无菌操作的方法，把组织（或器官）从动物体内取无菌操作的方法，把组织（或器官）从动物体内取 出，经酶或其它方式消化处理，使分散成单个细胞出，经酶或其它方式消化处理，使分散成单个细胞 ，然后在人工条件下培养，使其不断地生长和繁殖，然后在
7、人工条件下培养，使其不断地生长和繁殖 。原代培养是建立各种细胞系的第一步。原代培养是建立各种细胞系的第一步。9动物细胞原代培养过程图 取材 切割 消化接种培养10n n一、取材的基本要求一、取材的基本要求n n（1 1）取材要注意新鲜和保鲜）取材要注意新鲜和保鲜 新鲜组织易于培养成功，取材时应新鲜组织易于培养成功，取材时应 尽量在尽量在46h46h内能制作成细胞，尽快入箱培养，若不能即时培养，内能制作成细胞，尽快入箱培养，若不能即时培养， 应将组织浸泡于培养液内，于应将组织浸泡于培养液内，于4 4存放。若组织块较大，应在清存放。若组织块较大，应在清 除表面血块、坏死组织、脂肪和结缔组织后，切碎
8、于培养液内除表面血块、坏死组织、脂肪和结缔组织后，切碎于培养液内 4 4存放，但时间不能超过存放，但时间不能超过24h24h。对于已切碎的组织或血液、淋巴。对于已切碎的组织或血液、淋巴 组织应加入含组织应加入含10%10%二甲基亚砜二甲基亚砜 (DMSO) (DMSO) 的培养基，按细胞冻存方的培养基，按细胞冻存方 式于液氮中冷冻保存。式于液氮中冷冻保存。n n（2 2）取材应严格无菌）取材应严格无菌 所取标本材料应在无菌条件下进行，为了所取标本材料应在无菌条件下进行，为了 确保无菌，对所取材料若疑有污染的可能，应将所取组织在含高确保无菌，对所取材料若疑有污染的可能，应将所取组织在含高 浓度抗
9、菌素（浓度抗菌素（400400单位单位/mL/mL）甚至加入适量的两性霉素）甚至加入适量的两性霉素B B或或10%10%达达 克宁液的培养液内于克宁液的培养液内于4 4下存放下存放2 2小时以上，再用小时以上，再用PBSPBS洗洗2323次，次， 以确保所取材料无菌。要用无菌包装的器皿或事先消毒好的带少以确保所取材料无菌。要用无菌包装的器皿或事先消毒好的带少 许培养液（内含许培养液（内含400400单位单位/mL/mL抗菌素）的小瓶等便于携带的物品抗菌素）的小瓶等便于携带的物品 来取材，所取材料应避免接触有毒有害的化学物质，如碘、汞等来取材，所取材料应避免接触有毒有害的化学物质，如碘、汞等 。
10、原代细胞的取材 11（3）取材和原代细胞制作时，要用锋利的器械，如手术刀 或剃须刀片切碎组织，尽可能减少对细胞的机械损伤。 （4）要仔细去除所取材料上的血液（血块）、脂肪、坏死 组织及结缔组织，切碎组织时应避免组织干燥，可在含少 量培养液的器皿中进行。 （5）取材应注意组织类型、分化程度、年龄等，一般来讲 ，胚胎组织较成熟个体组织容易培养，分化低的较分化高 的组织容易生长，肿瘤组织较正常组织容易培养。取材时 应尽量选用易培养的组织进行培养。 （6）原代细胞取材时要同时留好组织学标本和电镜标本。 对组织的来源、部位、包括供体的一般情况要做详细的记 录，以备以后查询。12原代细胞的分离和制作 人或
11、动物体内（或胚胎组织）由于多种细胞结合紧密，不利于各个细 胞在体外培养中生长繁殖，即使采用1mm3的组织块，也只有少量处于 周边的细胞可能生存和生长，若需获取大量细胞，必须将现有的组织块 充分散开，使细胞解离出来，常采用的方法如下：一、悬浮细胞的分离方法组织材料若来自血液、羊水、胸水或腹水的悬液材料，最简单的方 法是采用1000r/min的低速离心10分钟，若悬液量大，可适当延长离心时 间，但速度不能太高，延时也不能太长，以避免挤压或机械损伤细胞， 离心沉淀用无钙、镁PBS洗两次，用培养基洗一次后，调整适当细胞浓 度后再分瓶培养，若选用悬液中某些细胞，常采用离心后的细胞分层液 ，因为，经离心后
12、由于各种细胞的比重不同可在分层液中形成不同层， 这样可根据需要收获目的细胞 13二、实体组织材料的分离方法 （一）机械分散法所取材料若纤维成分很少，如脑组织，部分胚胎组织可采用剪刀剪切、用吸管吹打分 散组织细胞或将已充分剪碎分散的组织放在注射器内（用九号针），使细胞通过针头 压出，或在不锈钢纱网内用钝物压挤（常用注射器钝端）使细胞从网孔中压挤出。此 法分离细胞虽然简便、快速，但对组织机械损伤大，而且细胞分散效果差。此法仅适 用于处理纤维成分少的软组织。14（二）消化分离法1、酶消化分离法 酶消化分离法常采用胰蛋白酶和胶原酶，其分离方法如下： （）胰蛋白酶分散技术 胰蛋白酶（简称胰酶）是广泛应用
13、的消化剂。胰蛋白酶是一种胰脏制品，对蛋白质有水 介作用，主要作用于赖氨酸或精氨酸相连接的肽键，使细胞间质中的蛋白质水介而使细胞 分散开胰蛋白酶对细胞的作用，取决于细胞类型、酶的活力、配制的浓度、消化的温度 、无机盐离子、pH以及消化时间的长短等。细胞类型 胰蛋白酶适于消化细胞间质较少的软组织,能有效地分离肝、肾、甲状腺、 羊膜、胚胎组织、上皮组织等。而对含结缔组织较丰富的组织,如 乳腺、滑膜、子宫、纤 维肉瘤、肿瘤组织等就无效酶的浓度 胰蛋白酶一般采用的浓度为0.1%-0.25%(活力1:200或1:250) 分离方法如下：过夜冷消化 将取得的组织用Hanks液洗三次，剪成碎块大小为4毫米左右
14、，用Hanks 液洗23次以除去血球和脂肪组织，再加入0.25%的胰蛋白酶，摇匀后放4过夜，次日再 用Hanks液洗涤，弃去上清，共洗23次，然后，加入少量营养液吹打分散，细胞计数，按 适当的浓度分瓶培养。 （）胶原酶（Collagenase）消化法 适于消化纤维性组织、上皮组织以及癌组织，它对细胞间质有较好的消化作用可用PBS 和含血清的培养液配制，即操作简便又可提高细胞成活率，最终浓度200u/mL或0.10.3mg/mL。152、非酶消化法（EDTA消化法）常用不含钙、镁离子的PBS配成0.02%的工作液，对一些组织，尤其是上 皮组织分散效果好 消化分离法的操作步骤： （1）剪切 把组织
15、块剪碎，呈15mm3大小的组织块。（）加液漂洗 将碎组织块在平皿（或三角烧瓶）中用无钙镁PBS洗2-3次（采 用倾斜，自然沉降法）。 （3）消化 加入消化液（胰蛋白酶或胶原酶或EDTA）于37水浴中作用适当时 间（中间可轻摇12次），若组织块膨松呈絮状可终止，若变化不大可更换一次消 化液，继续消化直至膨松絮状为止。胰蛋白酶消化时间不宜过长。 （4）弃去消化液 采用倾斜自然沉降或低速离心法尽量弃去消化液。 （5）漂洗 将含有钙、镁离子的培养基沿瓶壁缓缓加入，中止消化反应，采用漂 洗法洗2-3次后，加入完全培养基。 （6）机械分散 采用吸管吹打或振荡法，使细胞充分散开后用纱网或34层无菌 纱布过滤
16、后分瓶培养，若要求不高可采用倾斜自然沉降510分钟，吸上层细胞悬液 进行分瓶培养。161、组织块培养法(1)按照前述方法取材，将组织剪成或切成1mm3大小的小块，并加入少 许培养基使组织湿润。(2)将小块均匀涂布于瓶壁，每小块间距0.2 cm0.5cm，一般在25mL培 养瓶(底面积为17.5cm2)可接种2030小块为宜,小块放置后,轻轻翻转培养 瓶,使瓶底朝上,然后于瓶内加入适量培养基盖好瓶塞,将瓶倾斜放置在37温 箱内。(3)培养24小时，待小块贴附后，将培养瓶缓慢翻转平放，静置培养，动 作要轻，严禁摇动和来回振荡，以防由于冲动而使小块漂起而造成培养失败 ，若组织块不易贴壁可预先在瓶壁涂一薄层血清、胎汁或鼠尾胶原等。开始 培养时培养基不宜多，以保持组织块湿润即可，培养24小时后再补液，培 养初期移动和观察时要轻拿轻放，开始几天尽量不去搬动，以利贴壁和生长 ，培养35天时可换液，一方面补充营养，一方面去除代谢产物和漂浮小块 所产生的毒
