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1、实验二 显微镜油镜的使用及 细菌的简单染色法 一、实验目的：1.学习并掌握普通光学显微镜油镜的使用技术；2.学习微生物制片、染色的基本技术，掌握细菌的简单染色法及无菌操作技术； 3.观察细菌的基本形态。 二、实验原理：1、染色原理：用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。碱性染料的离子带正电荷，能和带负电荷的物质结合。因细菌蛋白质等电点较低，当它生长于中性、碱性或弱酸性的溶液中时常带负电荷，所以通常采用碱性染料（如美蓝、结晶紫、碱性复红或孔雀绿等）使其着色。酸性染料的离子带负电荷，能与带正电荷的物质结合。当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时，细菌所带正电荷增加，因此易被伊红
2、、酸性复红或刚果红等酸性染料着色。中性染料是前两者的结合物又称复合染料，如伊红美蓝、伊红天青等。简单染色法:是只用一种染料使细菌着色以显示其形态的染色法，简单染色不能辨别细菌细胞的构造。2、显微镜油镜工作原理：利用油镜不但能增加照明度，更主要是能增加数值口径，因为显微镜的放大效能是由其数值口径决定的。所谓数值口径，即光线投射到物镜上的最大角度（称为镜口角）的一半正弦，乘上玻片与物镜间介质的折射率所得的乘积，可用下列公式表示：NA=nsinNA:数值孔径n:介质折射率 ：镜口角的半数 显微镜的分辨率是指显微镜能够辨别两 点之间最小距离的能力。它与接物镜的数 值口径成正比，与光波长度成反比，因此
3、接物镜的数值口径愈大，光波波长愈短， 则显微镜的分辨力愈大，被检物体的细微 结构也愈能明显地区别出来。能辨别两点之间最小距离= 1/2光波长度数值口径 = 1/2NA 三 、实验器材1、活材料：培养18-24h的金黄色葡萄球菌和芽孢杆菌。 2、染色液和试剂：复红、美兰、二甲苯、香柏油。 3、器材：载玻片、接种杯、酒精灯、擦镜纸、显微镜。四、实验步骤：1、涂片：取干净载玻片一块，在载玻片的左、右各加一滴蒸馏 水，按无菌操作法取菌涂片，左边涂金黄色葡萄球菌，右 边涂芽孢杆菌，做成薄的涂面，注意取菌不要太多。整个过程中要注意无菌操作。（示范无菌操作技术）2、干燥：让涂片自然晾干或者在酒精灯火焰上方文
4、火烘干。3、固定：手执玻片一端，让菌膜朝上， 通过火焰2-3次固定（以不烫手为宜）。4、染色：将固定过的涂片加复红或美兰染色1-2min。5、水洗：用水洗去涂片上的染色液。6、干燥：将洗过的涂片放在空气中晾干或用吸水纸吸干。7、镜检：先低倍观察，再高倍观察，并找出适当的视野后，将高倍镜转出，在涂片上加香柏油一滴，将油镜头浸入油滴中仔细调焦观察细菌的形态。 8、绘图：9、实验完毕后的处理：将浸过油的镜头按下述方法擦拭干净：a.先用擦镜纸将油镜头上的油擦去。b.用擦镜纸沾少许二甲苯将镜头擦23次。c.再用干净的擦镜纸将镜头擦23次。 看后的染色玻片用废纸将香柏油擦干净，再 用洗衣粉清洗。五、结果与
5、思考题1、油镜与普通物镜在使用方法上有何不同？应注意些什么？2、按比例绘出你所观察到的细菌的形态，并显示两菌的排列方式。六、注意事项1、油浸物镜的工作距离（指物镜前透镜的表面到被检物体之间的距离）很短，一般在0.2mm以内，再加上一般光学显微镜的油浸物镜没有“弹簧装置”，因此使用油浸物镜时要特别细心，避免由于“调焦”不慎而压碎标本片并使物镜受损。2、染色过程中勿使染色液干涸。用水冲洗后，应吸去玻片上的残水，以免染色液被稀释而影响染色效果。简单染色实验步骤涂片 干燥 固定 染色水洗 干燥 镜检结果与思考题： 1、油镜与普通物镜在使用方法上有何不同？应注意些什么？ 2、按比例绘出你所观察到的细菌的形态，并显示两菌的排列 方式。复红或美蓝1-2min实验报告的撰写要求实验报告必须以实事求是、严肃认真的科学态度，按照指 导书的要求按时完成。实验报告应该简明扼要、叙述准确、数 据完整、绘图清晰且写实，应有讨论、有分析，结论明确。一 般应包括以下一些内容： 1 实验项目名称； 2 实验目的； 3 实验原理； 4. 实验材料； 5 实验步骤； 6 实验结果与讨论。
