生物化学技术原理及应用

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1、南京农业大学 生命科学学院生物化学技术原理及应用第七章 光谱与质谱*2南京农业大学 生命科学学院紫外-可见光谱红 外 光 谱质 谱 法核 磁 共 振1234分 光 光 度 法5荧 光 分 析 法6*2南京农业大学 生命科学学院第七章 光谱与质谱v 光谱是复色光经过色散系统（如棱镜、光栅）分光后，被 色散开单色光按波长（或频率）大小而依次排列的图案。v 光波是由原子内部运动的电子产生的。各种物质的原子内部电子 的运动情况不同，所以*3南京农业大学 生命科学学院它们发射的光波也不同。研究不同物质的发光 和吸收光的情况，有重 要的理论和实际意义， 已成为一门专门的学科 光谱学。*南京农业大学 生命科

2、学学院4第七章 光谱与质谱v 由于每种原子都有自己的特征谱线，因此可以根据光谱来 鉴别物质和确定它的化学组成，这种方法叫做光谱分析。v做光谱分析时，可以利用发射光谱，也可以利用吸收光谱 这种方法的优点是非常灵敏而且迅速。某种元素在物质中的 含量达10-10克，就可以从光谱中发现它的特征谱线，因而能够把它检查出来。v 光谱的分类：n按波长区域不同，光谱可分为红外光谱、可见光谱和紫外光谱；n按产生的本质不同，可分为原子光谱、分子光谱；n按产生的方式不同，可分为发射光谱、吸收光谱和散射光谱；n按光谱表观形态不同，可分为线光谱、带光谱和连续光谱。*5南京农业大学 生命科学学院第七章 光谱与质谱v 由于

3、每种原子都有自己的特征谱线，因此可以根据光谱来 鉴别物质和确定它的化学组成，这种方法叫做光谱分析。v做光谱分析时，可以利用发射光谱，也可以利用吸收光谱 这种方法的优点是非常灵敏而且迅速。某种元素在物质中的 含量达10-10克，就可以从光谱中发现它的特征谱线，因而能够把它检查出来。v 光谱的分类：n按波长区域不同，光谱可分为红外光谱、可见光谱和紫外光谱；n按产生的本质不同，可分为原子光谱、分子光谱；n按产生的方式不同，可分为发射光谱、吸收光谱和散射光谱；n按光谱表观形态不同，可分为线光谱、带光谱和连续光谱。*6南京农业大学 生命科学学院第七章 光谱与质谱v 分光光谱技术可用于：n通过测定某种物质

4、吸收或发射光谱来确定该物质的组成；n通过测量适当波长的信号强度确定某种单独存在或其他物质 混合存在的一种物质的含量；n通过测量某一种底物消失或产物出现的量同时间的关系，示 踪反应过程。v 鉴定分子式、结构式的方法（四大名谱）：n质谱。离子峰、碎片峰，物质大小测定。n紫外光谱。反映分子中共轭体系状况。n红外光谱 。官能团鉴定、分子中环、双键数目。n核磁共振。验证上述方法的正确性，提供分子二、三级结构 信息。*7南京农业大学 生命科学学院第一节 紫外-可见光谱v 有机分子吸收紫外光后，发生电子能级的跃迁，所测得的吸收光 谱；一般紫外光谱仪所用的波长范围为200nm-800nm，即包括可 见光区，因

5、而也叫紫外-可见光谱。v 在有机化合物的结构测定中，紫外-可见光谱与红外光谱不同，它一般 不能用来鉴别具体的官能团，而能用来推测分子中是否存在发色团和 共轭体系，只要分子含有相同的发色团和共轭体系，就有十分相似的 紫外光谱。v 有机物的紫外吸收光谱受共轭效应，互变异构效应及溶剂效应等因素 影响。*8南京农业大学 生命科学学院第一节 紫外-可见光谱v 紫外光谱的应用：n单独使用紫外光谱进行有机化合物结构分析比较困难，紫外光谱只有 与其它物理、化学资料及其它光谱方法结合，才能发挥较大作用。n紫外光谱在确定发色团种类，判断某些方面的异构体及确定不饱和化 合物的结构骨架等方面起重要作用。n在结构分析中

6、应用：顺反异构体的判别；有机化合物可能结构的推断 ；有机物分子量的确定。v 注意：n近紫外区200300nm 空气无干扰n测定时样品放在石英杯中n紫外区小于200nm空气有吸收峰，须在真空中测定v 谱带特征位置、定性由辐射波长而定；强度、定量由辐射能量决定。*9南京农业大学 生命科学学院第一节 紫外-可见光谱v 紫外光谱的应用：n从吸受光谱中初步推断官能团：n一个化合物在220-800nm范围内无吸收（1.0的溶液，可通过稀释或用薄的吸收池来降低吸 光度。n减小仪器误差。用稳压器稳定电源以使入射光强度保持不变；吸收 池厚度应一致，透光性好，不要用手摸透光面；吸收池与入射光线 应垂直，否则会因光

7、程增大而发生误差。 *47南京农业大学 生命科学学院第五节 荧光分析法1. 基本原理1.1. 基本概念v 某些物质受到光的照射，在吸收某些特定波长的光后还会发射出 比原来吸收波长更长的光的现象称为光致发光，常见的光致发光 有荧光和磷光两种。v 荧光是指物质吸收光子能量而被激发，然后从激发态的最低振动 能级返回基态时所辐射的光。根据物质的荧光谱线位置及强度进 行物质鉴定和含量测定的方法称为荧光分析法。v 根据研究对象的不同，荧光可分为原子荧光分析法和分子荧光分 析法，其中在生命科学中用得较多的是分子荧光分析法。v 分子荧光分析法是基于某些有机物质分子在光激发时发射荧光所 建立起的测定方法，根据激

8、发光的波长范围又可分为紫外-可见 荧光、红外荧光和X射线荧光，本章主要介绍紫外-可见荧光。*48南京农业大学 生命科学学院1.2. 荧光分析法的特点（优点）：n灵敏度高，选择性好，其检测限达10-10g/mL，甚至可达10-12 g/mL，而一般紫外-可见分光光度法的检测限只有10-7g/mL。n荧光分析法不仅能直接测定荧光物质，也能通过衍生反应测 定非荧光物质。n信息量大：荧光光谱能提供较多的信息，例如激发谱、发射 谱、峰位、峰强度、荧光寿命等。荧光光谱还可以检测一些 紫外-可见吸收光谱检测不到的时间过程过程。荧光产生包括 两个过程：吸收以及随之而来的发射。两个过程中有一个时 间延搁，大约为

9、10-9秒，由于荧光有一定的寿命，因此可以检 测一些时间过程与其寿命相当的过程。n动态线性范围宽，方法简便，重现性好，取样量少，仪器设 备不复杂。*南京农业大学 生命科学学院491.3. 荧光的产生v 当室温下分子受到光的照射时，便吸收与它的特征频率相一致的 光线，其中某些电子由原来的基态能级跃迁到第一电子激发态或 更高电子激发态中的各个不同振动能级，这就是在分光光度法中 所述的吸光现象。*南京农业大学 生命科学学院50v 吸收外来光子后被激发到激发 态的分子，可以通过多种途径 丢失能量，回到基态，这种过 程称为弛豫。在很多情况下， 分子回到基态时，能量通过热 量等形式散失到周围。但是在 某些

10、情况下，能量能以光子发 射的形式释放出来。如果能量 以光子形式释放，则放出的光 称为荧光。1.4. 荧光的产生v 当由于荧光的频率低于入射光的频率，因此测量到的荧光频率与 入射光的频率不同。同时，作为发射光，荧光是从与入射光成直 角的方向上检测。这样，荧光不受来自激发光的本底干扰，可以 达到很高的灵敏度，一般比吸收光谱高两个数量级左右。v 此外，由于荧光有一定的寿命，且其寿命比紫外吸收的时间过程 （10-15秒）要长，因此一些用紫外观测不到的变化过程（如生色团及其环境的变化），恰好可以用荧光来观测。在紫外吸收的时 间过程（10-15秒）中，生色团及其环境基本上是静止不变的。而在很多反应中，溶剂

11、的重新排列和分子的运动过程发生的时间与 激发态的寿命是同一数量级。*南京农业大学 生命科学学院511.5. 激发谱和发射谱：v 荧光光谱包括激发谱和发射谱两种。n激发谱：是荧光物质在不同波长的激发光作用下测得的某一波长处 的荧光强度的变化情况，也就是不同波长激发光的相对效率；n发射谱：则是某一固定波长的激发光作用下荧光强度在不同波长处 的分布情况，也就是荧光中不同波长的光成分的相对强度。v 激发谱是表示某种荧光物质在不同波长的激发光作用下所测得的 同一波长下荧光强度的变化，而荧光的产生又与吸收有关，因此 激发谱和吸收谱极为相似，呈正相关，镜象对称关系。v 在发射谱中最大荧光强度的位置称为max

12、 ，它是荧光光谱的一个重要参数，对环境的极性和荧光团的运动很敏感。*南京农业大学 生命科学学院521.5. 天然荧光生色团和荧光探针：v 生物化学中主要的荧光生色团可分为天然荧光生色团和荧光指示 剂（荧光探针）两类。v 天然荧光生色团：n天然的荧光生物分子只有芳香族氨基酸、核黄素、维生素A、叶绿 素和NADH等少数分子，核酸中的碱基没有显著的荧光，只有tRNA 中的Y碱基（二氢尿嘧啶）是个例外。在蛋白质的荧光谱中，由色 氨酸残基发出的荧光占主导地位。 v 判断化合物能否产生荧光的标准：n长共轭结构：具有共轭双键体系的分子容易产生荧光。绝大多数荧 光物质含有芳香环或杂环。任何能使电子共轭度提高的

13、结构变化都 将提高荧光效率，或使荧光波长红移。n刚性平面结构：具有刚性平面结构的有机分子容易发荧光。平面构 型或分子刚性增加，荧光增强。n取代基的类型和位置；环境、溶剂、温度、pH等均会影响分子结构 ，从而影响荧光。 *南京农业大学 生命科学学院531.6. 天然荧光生色团和荧光探针：v 荧光探针：n总的来说，天然的荧光生物分子种类很有限，而且荧光强度 较弱。为了研究多数的不发光的生物分子，人们广泛利用一 类能产生稳定荧光的小分子，把这些小分子和大分子结合起 来，或者插入大分子中，根据这些较小的荧光分子性质的改 变，分析大分子的结构，这类小分子称为荧光探针。n荧光探针的分子的几个基本要求：n能

14、产生稳定的，较强的荧光。n探针与被研究分子的某一微区必须有特异性的 结合，而且结 合得比较牢固。n探针的荧光必须对环境条件较敏感。n结合的探针不应影响被研究的大分子的结构和特性。*南京农业大学 生命科学学院541.7. 荧光分析光谱：v 将激发光用单色器分光后，连续顺次测定每一波长由激发所引起 的荧光的强度，然后以荧光强度为纵坐标，以激发光波长为横坐 标作图所得到的曲线，称为该荧光物质的激发光谱。激发光谱中 最高峰处的波长能使荧光物质发射出最强的荧光。v 保持激发光的波长和强度不变，让物质所发射的荧光通过单色器 照射到检测器上，调节单色器至各种波长，并测出相应的荧光强 度，然后以荧光强度为纵坐

15、标，以相应的荧光波长为横坐标作图 ，所得曲线称为该荧光物质的荧光发射光谱，简称荧光光谱。v 对于某一荧光物质的稀溶液，在一定波长和一定强度的入射光照 射下，当液层的厚度不变时 ，所发生的荧光强度和该溶液的浓度 成正比，这是荧光定量分析的基础。v 在建立荧光分析方法时，须根据荧光光谱来选择适当的测定波长 。激发光谱和荧光光谱是荧光物质定性的依据。*南京农业大学 生命科学学院55第五节 荧光分析法2. 荧光分析仪的原理和结构v 荧光分析中常用的仪器主要有荧 光计和荧光分光光度计两种。v 主要都是由光源、单色器（滤光 片或光栅）、狭缝、样品室、信 号检测放大系统和信号读出、记 录系统组成。v 右图是

16、荧光分光光度计的结构示 意图，如果将激发单色器改为滤 光片则为滤光片-单色器荧光计，如果将单色器全部改为滤光片 则为滤光片荧光计。*56南京农业大学 生命科学学院第五节 荧光分析法2. 荧光分析仪的原理和结构v 三种荧光分析仪的区别：n滤光片荧光计不能测定光谱，但可用于定量分析。n滤光片-单色器荧光计不能测定激发光谱，但可测定荧光光谱及用于定量分析。n荧光分光光度计既可测量某一波长处的荧光强度进行定量分析， 还可绘制激发光谱及荧光光谱。v 在荧光计和荧光分光光度计工作过程中，由光源发出的紫外可见 光通过激发单色器分光后照射到样品溶液中，在特定波长的激发 光激发下，样品荧光物质发出荧光，通过发射单色器后照射到检 测器上，检测器将记录各荧光的波长及荧光强度。该过程中，为 防止激发光的干扰，在与激发光垂直的方向检测样品的荧光。*57南京农业大学 生命科学学院第五节 荧光分析法3. 荧光分析法的定性和定量v 定性分析：n每种荧光物质在一定条件下都有其特定的激发光谱和荧光光谱，相 比只能得到被测物质的一种特征吸收光谱，荧光分