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1、实验四 细菌质粒的接合转移 李晓华 程国军一：目的要求 了解在自然条件下微生物遗传信息传递的 方式； 掌握细菌质粒转移的原理和流程。 二：基本原理 在质粒转移过程中，供体菌与受体菌 细胞通过结合作用紧密接触，质粒从 供体细胞向受体转移，同时进行质粒 复制，这就是结合转移的过程。按能 否自主转移，将天然存在的质粒分为 两大类。 1转移型质粒：多为低拷贝的大质粒，含有完整 的转移操纵子基因（tra）和转移起始位点。能在 同种或亲缘关系近的菌体细胞间进行转移。例如 ：大肠杆菌：F因子、R1、R100、R6K、RP4天蓝色链霉菌：致育性因子pSCP1、pSCP2 2非转移型质粒：多为高拷贝的小质粒，如
2、大肠 杆菌的ColE1、RSF1010等。由于缺少转移基因 （tra），不能自主转移，但由于含有与F质粒类 似的bom（或nic）位点或诱动基因mob（ mobilization），因而能被带有tra基因的转移性 质粒诱动而发生转移。 转移子的筛选 筛选培养基为：基本培养基+抗生素；供体和辅助大肠杆菌均营养缺陷型，不能 在基本培养基上生长；未转化成功的受体菌不能在有抗生素的平 板上生长。三：实验菌株 供体菌：E.coli DH5(pTR102) (TcR)，含有 mob基因 ； 受体菌: 紫云英根瘤菌 ( TcS) ； 辅助菌: E. coli MM294 (pPK2073)（SpeR ），含
3、有tra基因。 四：实验内容 准备 将受体、供体、辅助菌分别培养到对数期：供体菌：E.coli DH5(pTR102) (TcR)， LB + Tc 20g /ml，37震荡培养1夜；受体菌: Sinorhizobium fredii ( TcS)， TY, 28震荡培养2天；辅助菌: E. coli MM294 (pPK2073)（ SpeR），LB + Spe 50 g/ml 37震荡 培养1夜 用可调定量移液器吸取供体、辅助菌各 0.4ml， 吸受体菌0.6ml，都加入同一eppdorf管内（每 个同学做1管），放入离心机内，10000转/min 离心1分钟。 倒上清，向沉淀加 1ml
4、的 TY液体，用 tip上下 抽吸，洗涤菌体，再10000转/min离心1分钟， 倒上清，留100l左右用于悬浮菌体。 倒TY平板，然后用镊子取灭菌滤纸片贴于已准 备好的TY平板上（每2个同学1片，2-3片/平板 ）。用200l的 tip 抽吸eppdorf管内沉淀的菌 体，打散成浓菌液，将之加到滤纸片中央（切 勿倾斜平板，以免菌液流出滤纸片以外）,吹干 。 28培养2天。 操作步骤（第一天） 倒SM平板 将基本培养基（SM）溶化，加千分之一 的维生素混合液，然后加相应量的四环素 （15U/ml），每2人1皿。 另准备1瓶基本培养基，不加抗生素，用 于对照。 将倒好的平板用报纸包好后放入4冰箱 ，备用。（注：四环素在强光下易分解） 向灭菌青霉素瓶中加3ml无菌水，将已培 养的TY平板上的滤纸片用无菌镊子放入水 中，在震荡混匀器上洗菌体，充分打散。 向1ml的ep管加 0.9mL无菌水，取0.1ml 菌液，混匀。 吸取 200L涂皿。 少数同学另取稀释液，涂1板不加Tc的SM 做对照 。 平板放28 培养4-6天后看结果。操作步骤（第三天） 五：实验报告内容转移频率=SM+Tc平板的单菌落数/纯SM平板 的单菌落数 SM+Tc平板的单菌落数为：纯SM平板的单菌落数为：六：思考题 你认为本次实验方法适合哪些方面的研究 工作？
