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1、1试验一 外周血白细胞中DNA的提取与检测21.掌握真核细胞中DNA制备原理。2.熟悉从外周血白细胞中提取DNA的方法。3.掌握紫外分析仪检测DNA的原理。一、实验目的 3二、实验原理 破碎细胞DNA提取检测STMT破碎红细胞及白细胞的细胞膜离心收 集白细胞核SDS破膜苯酚氯仿抽提、乙醇沉淀洗涤琼脂糖凝胶电泳,紫外分析仪检测4三、仪器试剂 1、主要器具Eppendorf离心管电泳槽与电泳仪紫外分析仪台式离心机微量移液器52、主要试剂STMT:(蔗糖、Tris-HCl、MgCl2、TritonX-100) NE: (NaCl、EDTA Na2) TE: (Tris-HCl、 EDTA Na2 )
2、SDS 苯酚 氯仿 乙醇:无水乙醇、70%乙醇6四、操作步骤 吸去血清,混匀含有EDTA Na2的抗凝全血取0.3mL至EP管(1)加1mLSTMT,混匀 离心(12000rpm 1-2min),弃上清加1mL0.9% NaCl洗涤离心,弃上清(12000 rpm 1-2min)加460 L NE ,充分吹散沉淀加35 L 10%SDS,轻轻混匀。1、破碎细胞:2、DNA提取:加等体积苯酚,轻摇1min离心(12000rpm 3-5min)吸取上层水相于另一EP管(2 ) 加1/2体积苯酚+1/2体积氯仿-异戊醇,轻摇1min 离心(12000rpm 1min)取上 层水相于另一EP管(3)加
3、等体积氯仿-异戊醇离心(12000rpm 1min) 取上层 水相于另一EP管(4) 3、沉淀DNA加1/10体积3M NaAC,混匀加1mL无水冰乙醇置-20冰箱,0.5-1h 离心 (12000rpm 5min) 弃上清加70%冷乙醇1mL洗涤离心(12000rpm 5min) 弃上清自然干燥加50 L TE溶解,室温1h。74、电泳制胶:0.8%的琼脂糖凝胶(琼脂糖0.32g+TBE40ml,混合,加热熔化 ,冷至60,加EB20 L,制胶)加样:DNA样品10 L +载样缓冲液2 L,混匀,取10 L点样 电泳:点样端接负极,100V,40min紫外分析仪下观察结果8电泳结果图9五、注意事项 1、注意安全(苯酚具有强腐蚀性),操作戴手套; 2、所用玻璃器皿及溶液需经高压灭菌处理; 3、混匀试剂、吸取上清等操作时应动作要轻柔,避免动作剧烈; 4、离心分离两相时,应保证一定的转速和时间,且吸取上清时注意不要吸取到中间层及有机相; 5、沉淀后注意不要将DNA沉淀倒掉。10谢 谢 各 位