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1、微生物限度检查解读蔡美明 2005.11一、前言 1. 规定了微生物限度检查的定义及检查内容。 2. 实验的环境设施及操作的无菌要求。 3. 对检查中使用的助溶剂、中和剂、灭活剂的 作用及对微生物生长和存活的影响应进行验证 4. 霉菌培养温度改为2328，控制菌培养温 度改为以3537表示，细菌不变。 5. 增加检验结果的单位：10g，10ml。二、具体内容1. 检验量：指明了检验量是一次试验所用的 量；对贵重药、微量包装药可酌减 ，但不规定3g或5g；因沙门菌检 查的报告单位为10g或10ml，所以 检验量应另增10g或10ml（不含阳 性对照用量）。2. 供试液制备（与2000年版药典相比
2、的不同点）2000年版药药典2005年版药药典 （1）使用0.9%无 菌NaCl溶液使用pH7.0无菌NaCl-蛋白胨 缓冲液 （2）供试液制备 以加一定体积表示供试液制备以加至一定体积 表示 （3）供试液分三 类六种供试液分三类七种，但分类 更合理，函盖面更全 （4）制备方法有 限增加了新的制备方法，对培 养基稀释作了进一步详细 规定3. 细菌、霉菌、酵母菌计数 3.1平皿法： 3.1.1平皿法两版药典比较 3.1.2平皿法菌数报告规则 3.1.3平皿法其他内容，如阴性对 照试验等等与2000年版相同3. 细菌、霉菌、酵母菌计数（续 ） 3.2薄膜过滤法(为2005年版药典 新增内容) 3.
3、2.1操作 3.2.2阴性对照试验 3.2.3培养和计数 3.2.4菌数报告规则 3.1.1平皿法两版药典比较2000年版药药典2005年版药药典 （1）连续3个稀释 级连续23个稀释级（2）培养基约15ml 培养基约1520ml （3）每稀释级应 作 23个平皿每稀释级每种培养基至少制备2个 平皿 （4）无培养和计数栏增加对同级的两个 平板，当菌落数大于等于15个时， 则两个平板的菌落数不能相差1倍 或1倍以上3.1.1平皿法两版药典比较 （续） 2000年版药药 典2005年版药药典（5）培养基的 适用范围，规 定比较乱，表 达不清，不易 理解营养琼脂培养基用于进行 细菌计数；玫瑰红琼脂培
4、 养基用于进行霉菌及酵母 菌计数；酵母浸出粉胨葡 萄糖琼脂培养基用于进行 酵母菌计数,或用于特殊品 种（含蜂蜜、王浆的液体 制剂）进行酵母菌计数3.1.2平皿法菌数报告规则 2000年版药典存在许多不足 ，2005年版作了较大改动 1) 规定取两位有效数字报告。在 计数及中间计算过程中可多保留一 位。 2) 2005年版中： （1）与2000版相同 3.1.2平皿法菌数报告规则 (续 ) （2）当比值2时，与2000年版相同 ，以两级均数报告 当比值2时，规则与2000年版不同 ，如比值为25时，说明两级之间存 在较大差别，应以低稀释级的菌落数 乘以稀释倍数的值报告菌数 增加了比值大于5，或出
5、现高稀释级 菌数大于或等于低稀释级，应查明原 因。如试液有较强的抑菌作用，就不 能象上述一样忽略，必须调整方法 3.1.2平皿法菌数报告规则(续) （3）与2000年版相同 （4）与2000年版相同3.1.2平皿法菌数报告规则(续) 3) 还删除了2000年版中不合理 的3条;把培养基稀释列为具抑 菌活性供试品在任何情况下通 用的方法，不仅仅局限于某种 情况,而且方法也进行了合理 的调整，取样改为2ml，每1 ml所注平皿多个(不定) 3.2薄膜过滤法(为2005年版药典新增内容)3.2.1操作： 1）取相当于供试品1g（ml）的供试 液如取供试品1g（ml）或1：10供 试液10 ml或1：
6、100供试液100 ml ，加至适量稀释剂 ，混匀，过滤 2）冲洗方法、冲洗液、冲洗量（应 验证） 3）每种培养基至少制备一张膜 3.2薄膜过滤法(续)3.2.2阴性对照试验:等同于“空白试验”，即不加 供试品，按同法操作所得结 果，每种培养基均需做。3.2薄膜过滤法(续) 3.2.3培养和计数:与平皿法相同。但每张滤膜上菌数 应不得过100个，如果超过100个， 也就是每1g（ml）供试品含菌量较 多，可取适宜稀释级供试品1ml检查 ，例如，1：10取10ml检查，菌落 150个（150个/g），则改用1：10 取1ml检查，菌落为15个（150个/g ） 3.2薄膜过滤法(续) 3.2.4
7、菌数报告规则: 1) 报告每1g（ml）供试品菌落数； 2) 若膜上无菌落生长时，如果（每 张膜过滤1g(ml)供试品或1： 1010ml供试液，如每张膜过滤1： 1010ml供试液，则报告10个，依 此类推，为1乘以稀释倍数4. 控制菌检查 1) 大肠菌基本相同，主要修改是：当 MUG和靛基质两项中有一项为阳性 时，大肠菌的进一步确认通过大肠菌 菌落形态特征比较进行鉴别排除，增 加大肠菌形态特征，对进一步确认做 什么生化试验不作硬性规定（是否妥 ？），所以原有的生化试验结果判断 删除了。4. 控制菌检查(续) 2) 增加大肠菌群检查。 3) 沙门、金葡、绿脓也和大肠菌 一样作了调整，大同小异
8、。沙门 菌规定取供试品1 0 g（ml），另 加阳性对照10 g（ml）。 4) 增加了梭菌检查（无论试管或 平皿都要注意厌氧条件培养）。5. 微生物限度标准（略） 主要变化是由按剂型 控制改为按给药途径 控制。 6. 方法验证 6.1细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证： 1) 菌液制备（略） 2) 验证方法：主要分四组，测得四组数据。 供试品对照组：按拟定的菌落计数方法， 准确测定规定量(与试验组的相同)的供试液中 的菌落数，得供试品的已知含菌数-相当于 已知供试品的含量。 菌液组：测定所加的试验菌的菌数-相 当于精密称定对照品，得对照品的已知加入 量。6. 方法验证(续) 试验组（操作略）：
9、取已知含菌数的 供试液（试验可能用的最低稀释级供试 液1ml）和一定量的试验菌，进行测定 。测得试验组的总菌量，测定两份（两 个平皿），求平均值 计算试验组的回收率：试验组-供试品对照组（加入试验菌的测定值）菌液组（加入试验菌的已知值）（应70%）6. 方法验证(续) 稀释剂对照组：以相应稀释液替 代供试品，按试验组同法测定 计算稀释剂对照组的回收率：稀释剂对照组（加入试验菌的测定值）菌液组（加入试验菌的已知值） （应70%） 上述整个试验应至少进行3次独 立的平行试验，即分别平行取来 自同一批样品的三份供试品，平 行操作，作三次验证测定。每次 验证试验的试验组和稀释对照组 回收率必须两项同时
10、70%，所 被验证的检查法成立，否则 6.2控制菌的验证根据各品种项下微生物限 度检查标准中规定检查的控制 菌，进行相应的验证；根据检 查的控制菌选择对应的验证菌 ，大肠菌群选大肠埃希菌。 试验分二组 试验组（操作略）：规定量 一般为1：10供试液10ml（相 当于1g或1ml供试品），沙门 菌除外。取供试液、试验菌加 入增菌培养基中。按拟定方法 检查。 阴性菌对照组：检查大肠、大肠菌群、沙门-金葡为阴性 检查绿脓、金葡、梭菌-大肠为阴性进行阴性试验时，取供试液及阴性对 照菌，然后按控制菌检查的方法进行 试验，例如，验证控制菌大肠菌的检 查方法时，应取供试液及金葡菌，按 大肠菌检查方法进行增菌
11、检查，应不 得检出金葡菌。本阴性菌对照组试验 的目的是为了验证大肠菌检查方法的 专属性 7.总结 作为研发者，需要做的工作是： (1)建立方法； (2)验证方法； (3)制订质量标准 作为检验者，应该做的工作是：-按制订的方法（质量标准）检验 10号资料（质量标准研究资料）(1)实验仪器、试药（包括培养基、 稀释液、冲洗液、菌液，包括 培养基的相关试验） (2)根据什么原因、理由、依据拟定的方法 (3)按药典要求进行验证，主 要实验操作 (4)验证数据、结果，列表表 示 (5)得出结论 总而言之，无菌检查、微生物限度检 查，目的是检查药品中是否污染了微 生物，污染的程度怎样？为了要能准 确地检测其结果，必须排除实验环境 、实验仪器设备、实验用试药材料、 实验操作以及药品本身等等，对所污 染微生物的生存、生长，产生任何不 良影响的因素。上面所涉及的内容， 就是为了达到这个目的 谢谢大家
