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1、 血红蛋白血红蛋白两个两个肽链肽链 两个两个一一肽链肽链四个亚铁四个亚铁血红素基团红素基团每个肽链环绕一个亚铁血红素基团， 此基团可携带一分子氧或一分子二 氧化碳，血红蛋白因含有血红素而 呈红色。血红蛋白的特点：血红蛋白的特点：本课题学习目标本课题学习目标1 1、主要概念：、主要概念：凝胶色谱法 电泳法 缓冲溶液它们在血红蛋白的提取中分别起到什么作用。2.2. 主要原理：主要原理：凝胶色谱法分离蛋白质的原理电泳法分离样品的原理 缓冲溶液的组成和作用机理（一）（一） 凝胶色谱法（凝胶色谱法（分配色谱法分配色谱法）2.2.凝胶：凝胶： 大多数凝胶是由多糖类化合物（如葡聚糖或 琼脂糖）构成的多孔小球
2、体，内部有许多贯穿的通道。根据被分离物质的蛋白质相对分子质量的大 小，利用具有网状结构的凝胶，来进行分离。1.1.概念：概念：3.3.凝胶色谱法的原理凝胶色谱法的原理当相对分子量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子 量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长， 移动速度较慢;而相对分子量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通 道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。 相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。 依据的特性是：蛋白质分子量的大小。依据的特性是：蛋白质分子量的大小。4. 4.凝胶色谱法凝胶色谱法分离蛋白质的原理和的原理和具体过程具体过程（二）缓冲溶液（二）缓冲溶液1.1.概念概念
3、: :在一定的范围内，凡是能够抵制外加少量强酸或强 碱的影响使原来溶液PH值基本保持不变的混合溶液。能够抵制外界的酸和碱对溶液PH值的影响，维持PH基本不变。2.2.作用作用: :3.3.缓冲溶液的配制缓冲溶液的配制: :通常由12 种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲 剂的使用比例就可以制得在不同PH范围内使用的缓冲液 。4.4.提问：提问：在本课题中使用的缓冲液是在本课题中使用的缓冲液是:_ :_ , 其目的是其目的是: :利用缓冲液模拟细胞内的PH环境，保证血红蛋白的 正常结构和功能，便于观察(红色红色)和科学研究(活性活性)磷酸缓冲液（三）（三） 电泳：电泳：1.1.概念：概念：带电粒
4、子在电场作用下发生迁移的过程。 2.2.原理：原理： 许多重要的生物大分子，如多肽、 核酸等都具有可解离的基团，在一定的PH下，这 些基团会带上正电或负电。在电场的作用下， 这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移 动。电泳利用了待分离样品中各种分子带电性 质的差异以及分子本身的大小，形状的不同，使 带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中 各种分子的分离。 3.3.类型类型: :琼脂糖凝胶电泳、聚丙稀酰胺凝胶电泳。在在电场电场电场电场的作用下，的作用下，这这这这些些带电带电带电带电分子分子会会向着向着 与与其所其所带电带电带电带电荷相反的荷相反的电电电电极极移移动动动动琼脂糖凝胶电泳示意
5、图琼脂糖凝胶电泳示意图聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳1、在测定蛋白质分子量时常用十二烷基硫酸 钠（SDS）聚丙烯酰胺凝胶电泳。聚丙烯酰胺凝 胶是由单体丙烯酰胺和交联剂N,N-亚甲基双丙 烯酰胺在引发剂和催化剂的作用下聚合交联成的 具有三维网状结构的凝胶。N,N-亚甲基双丙烯酰胺（形成交联 ）丙烯酰胺和交联剂N,N-亚甲基双丙烯酰胺的交联共聚反应蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决 于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素。（SDSSDS的作用）的作用）为了消除净电荷对迁移率的影响， 可以在凝胶中加入SDS。2.2.原理：原理：SDSSDS能使蛋白质发生完全变性能使蛋白质发生完全变性。由几
6、条肽链组成 的蛋白质复合体在SDS的作用下会解聚成单条肽链解聚成单条肽链， 因此测定的结果只是单条肽链的分子量单条肽链的分子量。SDS能与各 种蛋白质形成蛋白质蛋白质SDSSDS复合物复合物，SDS所带负电荷 的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量原有的电荷量。因而掩 盖了不同种不同种蛋白质间的蛋白质间的电荷差别电荷差别，使电泳迁移率完 全取决于分子的大小。3. SDS3. SDS作用机理作用机理: :用SDS测定蛋白质分子量的方法使用使用SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳测定测定 蛋白质的分子量时，可选用一组蛋白质的分子量时，可选用一组已知分子已知分子 量的标准蛋白量的标准蛋白同
7、时进行电泳，根据已知分同时进行电泳，根据已知分 子量的标准蛋白的子量的标准蛋白的电泳区带位置电泳区带位置，可以测，可以测 定定未知蛋白质未知蛋白质的分子量。的分子量。市场上有高分子市场上有高分子 量、次高分子量及低分子量的标准蛋白试量、次高分子量及低分子量的标准蛋白试 剂出售。剂出售。二、实验操作二、实验操作样品处理粗分离纯化纯度鉴定1.1.样品处理：样品处理：（一）蛋白质提取和分离步骤（二）操作过程本课题可选用猪、牛、羊或其他脊椎 动物的血液来分离血红蛋白。 (1)(1)红细胞的洗涤红细胞的洗涤: : 洗涤目的洗涤目的: : 去除杂蛋白，以利于后续血红蛋白的 分离纯化，洗涤次数不可过少。 洗
8、涤操作：洗涤操作：1、采集血样。2、低速短时间离心（ 速度越高和时间越长，会使白细胞和淋巴细胞等一同 沉淀，达不到分离的效果）3、吸取血浆：上层透明的 黄色血浆。4、盐水洗涤：用五倍体积的质量分数为 0.9的氯化钠溶液洗涤。5、低速离心（低速短时间 ）6、重复4、5步骤三次，直至上清液中已没有黄色， 表明洗涤干净。(2)(2)血红蛋白的释放：血红蛋白的释放： 加蒸馏水到原血液体积，再加 40体积的甲苯 ，置于磁力搅拌器上充分搅拌10分 钟（加速细胞破裂）,细胞破裂释放出血红蛋白。 (3)(3)分离血红蛋白溶液：分离血红蛋白溶液：过程：过程：将搅拌好混合液转移到离 心管内，以2000r/min的
9、速度离心10 min。试管中溶液层次：试管中溶液层次：第1层（最上 层）：甲苯层（无色透明）；第2层（ 中上层）：脂溶性物质沉淀层（白色薄 层固体）；第3层（中下层）：血红蛋 白的水溶液层（红色透明液体）；第4 层（最下层）：杂质沉淀层（暗红色） 。分离：分离：用滤纸过滤，除去脂溶性沉 淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出 下层的红色透明液体。甲苯层（无色透明）甲苯层（无色透明）白色薄层固体白色薄层固体红色透明液体红色透明液体杂质沉淀层（暗红色）杂质沉淀层（暗红色）试管中溶液层次试管中溶液层次(4)(4)透透 析：析：过程：过程：取1ml的血红蛋白溶液装入透析袋中，将 透析袋放入盛有300ml的
10、物质的量浓度为20mmol/l的 磷酸缓冲液中（pH为7.0），透析12小时。透析目的：透析目的：除去样品中分子量较小的杂质。透析过程动画演示透析过程动画演示2.2.凝胶色谱操作凝胶色谱操作: : （1 1）凝胶色谱柱的制作：）凝胶色谱柱的制作：取长40厘米，内径1.6厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨 平。底塞的制作：打孔挖出凹穴安装移液管头部覆盖 尼龙网，再用100目尼龙纱包好，插到玻璃管的一端。注意事项注意事项 ：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否 则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。 顶塞的制作：打孔安装玻璃管。组装：将上述三者按相 应位置组装成一个整体。
11、安装其他附属结构。（2 2）凝胶色谱柱的装填）凝胶色谱柱的装填凝胶的选择：凝胶的选择：A、材料：交联葡聚糖凝胶（G-75）。 B、代表意义：“G”表示凝胶的交联程度，膨胀程度及 分离范围。75表示凝胶的得水值，即每克凝胶膨胀时吸 水7.5克。 凝胶的前处理：凝胶的前处理：配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量 的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后，配成凝胶 悬浮液。 凝胶色谱柱的装填方法：凝胶色谱柱的装填方法：A、固定：将色谱柱装置固 定在支架上。B、装填：将凝胶悬浮液一次性缓慢倒入 色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。 注意：1、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间 的空隙。 2、
12、装填凝胶柱时不得有气泡存在：因为气泡 会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。 洗涤平衡：洗涤平衡：装填完毕后 ，立即用缓冲液洗脱瓶，在 50cm高的操作压下，用300ml 的20mmol/l的磷酸缓冲液（pH 为7.0）充分洗涤平衡12小时 。注意：注意：1、液面不要低于凝 胶表面，否则可能有气泡混入 ，影响液体在柱内的流动与最 终生物大分子物质的分离效果 。2、不能发生洗脱液流干， 露出凝胶颗粒的现象。（2 2）凝胶色谱柱的装填）凝胶色谱柱的装填50cm50cm高高（3 3）样品加入与洗脱）样品加入与洗脱调节缓冲液面：调节缓冲液面：打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降 到与凝胶面平齐，
13、关闭出口。滴加透析样品：滴加透析样品：吸管吸1ml样品加到色谱柱的顶端，滴加 样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏 凝胶面。样品渗入凝胶床：样品渗入凝胶床：加样后打开下端出口，使样品渗入凝 胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。洗脱：洗脱：小心加入pH=7.0 的20mmol/l的磷酸缓冲液到适当 高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。 收集：收集：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集 流出液，每5ml收集一试管，连续收集。（在分离过程中，如 果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功） 注意：注意：正确的加样操作：1、不要触及并破坏凝胶面。2 、贴壁
14、加样。3、使吸管管口沿管壁环绕移动。（3 3）样品加入与洗脱）样品加入与洗脱注意：注意：正确的加样操作是：1、不要触及并破坏凝胶面 。2、贴壁加样。3、使吸管管口沿管壁环绕移动。思考下面的问题：思考下面的问题：让血红蛋白处在稳定的pH范围内，维持结构和功能正常 。1 1、在血红蛋白纯化的整个过程中不断用磷酸缓冲液处、在血红蛋白纯化的整个过程中不断用磷酸缓冲液处 理的目的是什么？理的目的是什么？2 2、与其他蛋白质相比，血红蛋白有什么特点？这一特、与其他蛋白质相比，血红蛋白有什么特点？这一特 点对你进行血红蛋白的分离有什么启示？点对你进行血红蛋白的分离有什么启示？血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色
15、谱分离时可以通过观察颜色 来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常 直观，大大简化了实验操作。 血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，包括：样品处样品处 理、粗分离、纯化和纯度鉴定理、粗分离、纯化和纯度鉴定。首先通过洗涤红细胞、血红蛋 白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液，即:样品的处理 ；再经过透析去除分子量较小的杂质，即样品的粗分离；然后 通过凝胶色谱法通过凝胶色谱法将相对分子质量较大的杂质蛋白除去，即:样 品的纯化；最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。3 3、你能描述血红蛋白分离的完整过程吗？、你能描述血红蛋白分离的完整过程吗？（三）三）SDSSDS
16、聚丙烯酰胺凝胶电泳（选做聚丙烯酰胺凝胶电泳（选做 ）2.2.试剂的配制：试剂的配制：鉴定血红蛋白纯度。1.1.目的：目的：3.方法步骤：（略）观察你处理的血液样品离心后是否分层（见教科书图5-18 ），如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白 的原因。此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴 细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的 提取纯度。三、实验结果分析与评价三、实验结果分析与评价1、你是否完成了对血液样品的处理？你能描述处 理后的样品发生了哪些变化吗？2、你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产生？你的色谱 柱装填得成功吗？你是如何判断的？由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支 与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。此外，还可 以加入大分子的有色物质，例如蓝色葡聚糖200
