血清蛋白质醋酸纤

《血清蛋白质醋酸纤》由会员分享，可在线阅读，更多相关《血清蛋白质醋酸纤（26页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。

1、 血清蛋白质醋酸纤 维素薄膜电泳2010-10-26 汪昭旋 黎小龙 李刚奇 赵亚军 1实验目的：n掌握电泳的基本原理，了解电泳仪 电泳槽的基本结构与功能。n熟悉电泳的基本过程与定量方法。 n熟悉血清电泳在临床诊断中的作用。21 1、电泳（、电泳（electrophoresiselectrophoresis）法）法带点粒子在直流电场中向着相反电带点粒子在直流电场中向着相反电极移动的现象称为电泳。极移动的现象称为电泳。3电泳原理：在一定pH条件下，不同的质点由于具有不同的等电点而带不同性质的电荷，因而在一定的电场中它们的移动方向和移动速度也不同，即它们的电泳迁移率不同，因此，可使它们分离。影响电

2、泳迁移率的外界因素：电场强度、溶 液的pH值、溶液的离子强度和电渗现象影响电泳迁移率的内在因素：质点所带净电 荷的量、质点的大小和形状4常见的电泳技术：l1.醋酸纤维膜电泳醋酸纤维膜电泳l l2.2.聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳l l3.3.琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳l l4.4.等电聚焦电泳等电聚焦电泳l l5.5.双向电泳双向电泳5采用醋酸纤维薄膜作为支持物的电泳方法称为醋酸纤维素薄膜电泳。醋酸纤维薄膜：将纤维素的羟基乙酰化醋酸纤维薄膜：将纤维素的羟基乙酰化为醋酸酯，溶于丙酮后制成有均一细密为醋酸酯，溶于丙酮后制成有均一细密微孔的薄膜，其厚度为微孔的薄膜，其厚度为0.10.10.

3、15mm0.15mm67优点：uu1.1.吸附作用小吸附作用小uu2.2.电渗作用小电渗作用小uu3.3. 需加样量少需加样量少uu4. 4. 亲水性小亲水性小8+白蛋白 (A)12实验原理：血清蛋白的pI大多在7.5以下，在pH8.6的巴比妥缓冲液中以负离子形式存在，并且蛋白质的分子量、立体构象、等电点以及形状也有差异，在电场中迁移速度不同，可以在醋酸纤维薄膜上分离成A、1、2、和五条区带。蛋白名称等电点分子量白蛋白4.88690005.061：20000 2：300005.1290000-1500006.85-7.50156000-3000009三、实验器材三、实验器材1. 电泳仪：为电泳

4、提供直流电源。 2. 电泳槽：为电泳提供场所。多用有机玻璃制成，电极用 铂丝。 3. 血清加样器 ：可用盖玻片或X胶片或微量加样器。 4. 醋酸纤维素薄膜：2cm8cm 5. 其它： 培养皿（直径9-10cm）、滤纸、玻璃板、镊子 等。DYY-5型稳压 稳流电泳仪DYY-型 电泳槽10实验试剂q巴比妥-巴比妥钠缓冲液 (pH8.6、I=0.06) q氨基黑10B染色液：氨基黑 10B 0.25g，用甲醇50mL、冰醋 酸10mL、水40mL溶解（可重复 使用）。 q漂洗液：甲醇45ml、冰醋酸 5ml和蒸馏水50ml，混匀。11实验操作流程n薄膜的准备 n电泳槽的准备n点样 n电泳 n染色与漂

5、洗脱色 12操作步骤：n准备：将巴比妥缓冲液加入电泳槽的电极 室 内，使正负极室的液面等高，电泳支架宽度正 好适合醋纤薄膜的长度，用四层纱布或滤纸做 盐桥，一端浸入缓冲液中，一端搭在支架上。膜的预处理：将薄膜切成28cm，先于膜 条无光泽面距一端1.5cm处用铅笔轻划一直线( 点样线)，再将薄膜无光泽面向下浸泡于巴比 妥缓冲液中，浸透为止（30min)。取充分浸透 的膜条，将薄膜无光泽面向上，滤纸吸取多余 的缓冲液，不要吸太干。133. 加样：用滴管吸取待测血清一滴于玻璃 片上，用点样器末端处蘸取少许样品，垂 直轻印（迅速均匀）到薄膜点样线上，使 血清完全渗透至薄膜内，形成一定宽度、 粗细均匀

6、的直线。 此步是实验的关键：以印章法加样时，以印章法加样时， 动作应动作应 轻、稳，用力不能太重，轻、稳，用力不能太重，以免将薄以免将薄 膜弄破或印出凹陷而影响电泳区带分离效膜弄破或印出凹陷而影响电泳区带分离效 果。果。点样前可先在滤纸上反复练习，掌握 点样技术后再正式点样。 144.平衡：待血清渗入薄膜后，将膜条无光泽面 向下置于电泳槽支架上，点样端靠近负极， 薄膜两端要紧贴滤纸（点样线不要压在滤纸 上），中间平直悬空，加盖密封，平衡5分 钟。5. 电泳：将电泳槽正负极分别与电源正负极接 好。开启电源，调节电流密度为0.5mA/cm ，如有10条宽2cm的膜条，其总宽度为 20cm，应使用电

7、流强度为20cm0.5mA/cm 10mA。电压15V/cm。通电50分钟左右， 关闭电源。6. 染色和漂洗：取下薄膜直接浸于氨基黑10B 染色液中，染色5分钟后取出，先用自来水 漂洗1-2次，然后用漂洗液漂洗34次，至 背景完全无色为止。157.7.定量定量 （1 1）洗脱比色洗脱比色：将各蛋白质区带仔细剪下，：将各蛋白质区带仔细剪下， 分置各试管中，另从空白背景剪块平均大小分置各试管中，另从空白背景剪块平均大小 的膜条置于空白管中。各管加入的膜条置于空白管中。各管加入0.4mol/l 0.4mol/l NaOHNaOH 4ml,4ml,于于3737水浴水浴2020分钟（不时振荡），分钟（不

8、时振荡）， 待颜色脱净即用波长待颜色脱净即用波长620nm620nm比色，以空白管调比色，以空白管调 零读取各管吸光度。零读取各管吸光度。 （2 2）计算计算: :吸光度总和（吸光度总和（T T）=A+=A+1 1+2 2+（吸光度）吸光度）16血清蛋白组分的相对百分数：血清蛋白组分的相对百分数： A%=A/T100% TA%=A/T100% T吸光度总和吸光度总和 1 1%=%=1 1/T100% /T100% 2 2%=%=2 2/T100%/T100% %=/T100%=/T100%=/T100% %=/T100%17(1)醋酸纤维素薄膜的预处理 1. 市售醋酸纤维素薄膜均为干膜片，薄膜

9、的 浸润与选膜是电泳成败的关键之一。为防止指纹 污染，取膜时应戴指套或用夹子。所选薄膜应厚 薄均匀，否则应弃去不用，以免造成电泳区带扭 曲，界线不清，背景脱色困难，结果难以重复。2. 由于薄膜吸水性比纸小，浸泡30 min以上是 保证膜片上有一定量缓冲液，并使其恢复到原来 多孔的网状结构，最好让薄膜吸满缓冲液后自然 下沉，这样可将膜片上聚集的小泡赶走。3. 点样时薄膜上的缓冲液不宜太多，但也不能 太干。注意事项注意事项: :18(2)(2)缓冲液的选择缓冲液的选择 1.1. 本实验常用的本实验常用的pH8pH86 6巴比妥缓冲液，其巴比妥缓冲液，其浓度为浓度为0.050.05O.09 molO

10、.09 molL L。2.2. 选用何种浓度与样品及薄膜的厚薄有关。选用何种浓度与样品及薄膜的厚薄有关。 缓冲液浓度过低，则区带泳动速度快，并缓冲液浓度过低，则区带泳动速度快，并由于扩散变宽；由于扩散变宽； 缓冲液浓度过高，则区带泳动速度慢，区缓冲液浓度过高，则区带泳动速度慢，区带分布过于集中，不易分辨。带分布过于集中，不易分辨。19(3)(3)加样量加样量 1.1. 加样品量的多少与电泳条件、样品性质、染色方加样品量的多少与电泳条件、样品性质、染色方 法与检测手段灵敏度密切相关。法与检测手段灵敏度密切相关。 2.2. 作为一般原则，检测方法作为一般原则，检测方法越灵敏越灵敏，加样量越少加样量

11、越少， 对分离更有利。如加样量过大，则电泳后区带分对分离更有利。如加样量过大，则电泳后区带分 离不清楚，甚至相互干扰，染色也较费时。离不清楚，甚至相互干扰，染色也较费时。3. 3. 点样好坏是获得理想图谱的重要环节之一点样好坏是获得理想图谱的重要环节之一，以，以 印章法加样时，动作应印章法加样时，动作应轻、稳轻、稳，用力不能太重用力不能太重，以，以 免将薄膜弄破或印出凹陷而影响电泳区带分离效果免将薄膜弄破或印出凹陷而影响电泳区带分离效果 。20注意事项1市售醋酸纤维素薄膜均为干膜片，薄膜的浸润与选膜是电泳成败的关 键之一。若飘浮于液面的薄膜在1530 s内迅速润湿，整条薄膜色泽 深浅一致，则此

12、膜均匀可用于电泳 2醋酸纤维素薄膜电泳常选用pH8.6巴比妥巴比妥钠缓冲液，其浓度 为0.050.09 mol/L。选择何种浓度与样品和薄膜的厚薄有关。缓冲 液浓度过低，则区带泳动速度快区带扩散变宽；缓冲液浓度过高，则 区带泳动速度慢，区带分布过于集中，不易分辨 3点样时，应将薄膜表面多余的缓冲液用滤纸吸去，以免引起样品扩散 。但不宜太干，否则样品不易进入膜内，造成点样起始点参差不起， 影响分离效果 4点样时，动作要轻、稳，用力不能太大，以免损坏膜片或印出凹陷影 响电泳区带分离效果 5电泳时应选择合适的电流强度，一般电流强度为0.40.6mA/cm膜宽 度。电流强度高，则热效应高；电流过低，则

13、样品泳动速度慢且易扩 散 6操作过程为防止指纹污染，应戴手套21临床意义：n血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳，通常 可分离白蛋白(Alb)、1、2、和- 球蛋白五个组分，正常人血清中各种 蛋白质浓度的差别较大，所以在许多 疾病时仅表现出轻微变化，往往没有 特异的临床诊断价值。n分析几种疾病的电泳分析结果，可以 看出较显著的变化。 22典型异常血清蛋白电泳图谱在异常电泳图谱中，肾病综合征、肝硬化和多发性骨髓 瘤(M蛋白血症型)最具有特征性，在临床上诊断意义 最大。23几种疾病的蛋白电泳变化 病名白蛋白1球蛋白2球蛋白球蛋白球蛋白 肾肾病弥温性肝损损害肝硬化-桥桥原发发性肝癌AFP多发发性骨髓瘤慢性炎症妊娠无丙种球蛋白血 症双白蛋白血症双峰24思思 考考 题：题：问答题问答题1.CAME1.CAME的基本原理是什么？的基本原理是什么？2.CAME2.CAME分离血清蛋白电泳时应注意哪些分离血清蛋白电泳时应注意哪些 问题？问题？251. 滤纸桥 2. 电泳槽 3. 醋酸纤维素薄膜 4. 电泳槽膜支架 5. 电极室中央隔板点样26