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1、第二十一章 临床免疫检验的质量保证 案 例l患者王某因双下肢股骨粉碎性骨折“，到 某县医院就诊。经过医院会诊讨论后认为患者 损伤严重，不易采取保守治疗，拟采用手术治 疗，并嘱咐该患者的主治医生黄某作好手术前 的一切检查和术前准备。经 检查，患者各项 指标均符合手术要求，但只有一项不大引人注 意的简单实验，出血时间（BT）异常，为6分 30秒。正常参考值（DUKE法）为14分，随 然 这一实验最近已被宣布停止使用，但在当 时的许多医院都将其作为手术前必查的一项筛 选指标。l黄某自信这个指标不会对手术产生影响， 但为了能够为再次术前讨论 中能够通过，他 擅自将出血时间改为3分30秒，结果手术方案
2、被通过。随后黄某作为主治医生在硬膜外麻醉 条件下为王某实施双下肢股骨粉碎性骨折切复 内固定 术。手术过程中王某出血过多，各种 止血措施效果不佳，最后出现失血性休克，经 抢救无效死亡。患者家属为此进行了医疗事故 鉴定和举报，该市医疗事故鉴定委员 会鉴定 结论为一级医疗责任事故。 l从1949年美国College of American Pathologists（简称CAP）首先开始研究临床 实验室室内质量控制（简称质控）问题，美国 学者Levery和Jenning于1950年发表第一篇关 于使用质控图的实验室室内质控，临床检验实 验室的室内质控工作正式拉序幕。 l到70年代，实验室质量控制进入一
3、个新的 阶段-全面质量管理，推行Good Laboratory Parctice（简称GLP）。进入80年代末期， GLP的统一标准产生了，发展到“认证实验室“ 管理阶段。 l 卫生部临床检验中心免疫质控室从 1988年开始在全国范围内开展乙肝标志物检验 的质量评价活动，一直采用这一套质量评价方 法，并在实践中不断实践、提高和完善，希望 能找出一条适合中国国情的，行之有效的质量 管理的道路。l质量保证(Quality Assurance,QA) 为一产 品或服务满足特定质量要求提供充分可信性所 必要的有计划的和系统的措施。 l室内质量控制（Internal Quality Control,IQ
4、C) 由实验室工作人员，采取一定 的方法和步骤，连续评价本实验室工作的可靠 性程度。一、与质量保证相关的定义l室间质量评价 （External Quality Assessment, EQA） 为客观比较一实验室的测定结果与靶值的差异，由外单位机构客观地评价实验室的结果，发现误差并校正结果l准确度 (accuracy) :待测物的测定值与其真值的一致性程度。l偏倚 (bias) 待测物的测定值与一可接受参考值之间的差异。l精密度(precision) 在一定条件下所获得的独立的测定结果之间的一致性程度。准确度好的实验，其精密度不一定好； 准确度差的实验，其精密度则不一定差；反之亦然。测定的精密
5、度与准确度之间的关系l 重复性条件(repeatability conditions) 是指在短的间隔时间内，在同一实验室对相同的测定项目使用同一方法和同一仪器设备，由相同的操作者获得独立的测定结果的条件。l批 (Run) 在相同条件下所获得的一组测定。 l均值（Mean） P270l标准差（Standard deviation, SD)l变异系数（Coefficient of variation, CV） l正态分布(Gaussian distribution) 当一质控物用同一方法在不同的时间重复多次测定，得到一个两头低，中间高，中为所有测定值的均值，左右对称的“钟形”曲线，又称高斯分布。
6、 l正态分布的基本统计学含义可用均数、标 准差（s）和概率来说明。l诊断敏感性（sensitivity of diagnosis） 是指将实际患病者正确地判断为阳性（真阳性）的百分率。l诊断特异性（specificity of diagnosis） 是指将实际无病者正确地判断为阴性（真阴性）的百分率。二、实验方法诊断效率评价l诊断效率（efficiency of diagnosis） 是指能准确区分患者和非患者的能力。l阳性预测值（positive predictive value, PPV） 是指特定试验方法测定得到的阳性结果中真阳性的比率。l阴性预示值(negative predictiv
7、e value, NPV) 是指特定试验方法测定得到的阴性结果中真阴性的比率。第二节 免疫检验 的质量控制原则l标本类型及采集容器l标本采集时间及患者准备l内源性干扰因素l外源性干扰因素一、标本的正确收集及处理l最常用的标本：血液，包括血清、血浆和全血。唾液或尿液 。l建议采用真空采血管及蝶形针具，以免直接接触血液。采集容器最好为一次性无菌密闭容器。标本类型及采集容器标本采集时间及患者准备l激素和治疗药物l感染性病原体抗原、抗体l肿瘤标志物l特定蛋白内源性干扰因素l类风湿因子、补体、异嗜性抗体、治疗性抗体、自身抗体、溶菌酶、磷脂、药物小分子、总蛋白浓度等l稀释标本l改变标记抗体l用变性IgG预
8、先封闭标本中RFl测抗原,可加入还原剂如2-巯基乙醇去除RFl使用特异的鸡抗体IgY作为标记或固相抗体类风湿因子干扰的排除补体干扰l固相抗体和标记二抗可抗体分子发生变构，从而其Fc段的补体C1q结合位点被暴露出来，这样C1q就成为一个中介物将二者交联起来，从而出现假阳性结果。l固相抗体也会因为活化补体的结合，封闭抗体的抗原表位结合能力，而引起假阴性结果或结果偏低。 补体干扰的排除l56 30min加热可使标本中补体C1q 灭活l使用特异的鸡抗体IgY作为标记或固 相抗体异嗜性抗体的干扰天然的异嗜性抗体（IgG）可分为 两类:l可结合于山羊、小鼠、大鼠、马和牛IgG的 Fab区域l可结合于小鼠、
9、马、牛和兔IgG的FC区表位 ，通过交联固相和标记的单抗或多抗而出现假 阳性反应。异嗜性抗体干扰的排除l使用特异的兔F(ab)2片段作为固相或标记抗体。l在标本或标本稀释液中加入过量的动物Ig，封闭可能存在的异嗜性抗体。但加入量不足或亚类不同时无效。l使用靶特异的非Ig亲和蛋白（Affibody）替代固相或标记抗体之一。采用噬菌体展示技术展示来自单个金黄色葡萄球菌A蛋白（SPA）联合文库的人IgA结合亲和蛋白，用于IgA的测定，不受异嗜性抗体的影响。l使用特异的鸡抗体作为固相和测定抗体。抗鼠Ig 抗体的干扰l抗鼠抗体对使用鼠源性单克隆抗体的免疫测定，可产生假阳性结果l 使用特异的抗体F(ab)
10、2片段作为固相或测定标记抗体。l 在标本或标本稀释液中加入过量的鼠Ig，封闭可能存在的抗鼠抗体。l 使用特异的鸡抗体IgG作为固相和测定抗体。鸡IgG不与人抗鼠抗体反应。干扰排除可采用下述方法:自身抗体干扰l自身抗体如抗甲状腺球蛋白、抗胰岛素等，能与其相应靶抗原结合形成复合物，在免疫测定方法中可干扰相应抗原抗体的测定。l为避免以上情况出现，可在测定前用理化方法将其解离。 溶菌酶干扰l双抗体夹心法ELISA测定中，溶菌酶可在包被的IgG和标记的IgG间形成桥接，从而导致假阳性。去除溶菌酶或将其封闭，Cu2+离子和卵白蛋白可有效地封闭溶菌酶，防止其联接IgG。外源性干扰 因素l溶血、细菌污染、标本
11、贮存时间过长、凝固不全、反复冻融标本溶血 l注意避免出现严重溶血。l血红蛋白类似过氧化物的活性，使反应显色。标本被细菌污染l细菌的生长，其所分泌的一些酶可能会对抗原抗体等蛋白产生分解作用l细菌的内源性酶如大肠杆菌的-半乳糖苷酶本身会对用相应酶作标记的测定方法产生非特异性干扰。 标本贮存时间过长 l标本在28下保存时间过长，IgG可聚合成多聚体，在间接法免疫测定中会导致本底过 深、甚至造成假阳性。l血清标本如是以无菌操作分离，则可以在2 8下保存一周，如为有菌操作，则建议冰 冻保存。样本的长时间保存，应在70以下 。 标本凝固不全 l血液采集后，离心分离血清没有完全凝固，离出的“血清”并非为完全
12、的血清，其中仍残留部分纤维蛋白原，易造成假阳性结果l血液标本采集后，应使其充分凝固后再分离血清，或标本采集时用带分离胶的采血管或于采血管中加入适当的促凝剂。冰冻保存标本避免反复冻融l反复冻融所产生的机械剪切力将对标本中的蛋白等分子产生破坏作用，从而引起假阴性结果。试剂准备、标本收集、测定方法和仪器操作写出“标准操作程序”(SOP) 二、标准化操作及流程l标准品和质控品的分类l标准品和质控品的基本条件三、标准品和质控品的应用标准品和质控品的分类l标准品即含量确定的处于一定基质中的特 性明确的物质。 l标准品分级:一级标准品为国际标准品二级标准品为国家标准品三级标准品为商品校准品l临床免疫检验实验
13、室应有充分合理的空间、良好的照明、空调及湿度维持设备l实验室仪器设备应保养良好，实验用品要达到相应的要求。四、实验室的环境、设施和设备第三节 质量保证、室内质控 和室间质评之间的关系IQC仅覆盖标本收集、实验室测定过程和结 果报告及其解释分析步骤；而EQA还包括一个较 大范围的实验室活动，诸如在标本接收中样本 处理的可靠性，以及测定结果的报告和解释。 QA覆盖了更宽范围的活动，最为重要的是标本 收集、结果报告和解释阶段。QA还应评价实验 报告的发出周期（及时性）、完整性和简洁性 。实验室工作的质量保证在确保患者治疗质量 上有重要意义。第四节 常用免疫检验的质量控 制l免疫检验质量控制中常用统计
14、 学方法的选择l定性免疫检验 l定量免疫检验 统计学质量控制:使用室内质控物与临床常规标本同时检测，然后根据室内质控物的测定结果，采用统计学的原理方法判断所进行的临床常规标本测定是否在控的一种质量控制措施。一、免疫检验质量控制中常用统计学 方法的选择统计学质控的特 点 l检验误差有两类：一是系统误差，一是随机误 差。l系统误差通常表现为质控物测定均值的漂移， 是由操作者所使用的仪器设备、试剂、标准品或校 准物出现问题而造成的，这种误差可以通过前述的 措施方法加以控制，是可以排除的。l随机误差则表现为测定SD的增大，主要是由实 验操作人员的操作等随机因素所致，其出现难以完 全避免和控制。l统计学
15、质控的功能就是发现误差 的产生及分析误差产生的原因，采取 措施予以避免。l开展统计质量控制前，应将可以 控制的误差产生因素尽可能地加以控 制，这不但是做好室内质控的前提， 也是保证常规检验工作质量的先决条 件。 基线测定l最佳条件下的变异（Optimal conditions variance, OCV）和常规条件下的变异（ Routine conditions variance, RCV）； l当RCV与OCV接近，或小于2 OCV时，则RCV 是可以接受的。以上为批间变异。临床免疫检测质控图的选择、绘制 及质控结果判断 Levey-Jennings质控图方法 l也称Shewhart质控图，
16、是由美国的Shewhart 于1924年首先提出，并用于工业产品的质量控制。l二十世纪五十年代初，Levey-Jennings将其引入临床检验的质量控制 。经Henry和Segalove的改良，即为目前常用的Levey-Jennings质控图。Westgard 规则 1981年，威斯康辛大学（University of Wisconsin）的 James Westgard 博士发表了实验室质量控制的论文， 为医学实验室设定了评价分析批的质量。Westgard系统的要素，依据自1950年代以来工业国家使用的统计 过程控制的原理。在Westgard 的设计中，有6个基础规则。这些规则可以分别或结合使用，评价分析批的质 量。 Westgard设计了表达质量控制规则的简化符号。几乎所有的质量控制规则可表达为NL，A为被评价的控制观 察数，L为评价控制观察数的统计限值。James Westgardl(1)统计学含义:稳定条件下，在20个IQC结果中不应有多
