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1、放射性核素示踪技术核医学教研室 Date1教学目的【掌握】放射核素示踪技术定义、原理。 【熟悉】1、放射性核素示踪技术的特点。2、核素示踪实验的基本类型。3、核素示踪实验的方法学。 【了解】常见的核素示踪技术类型及其原理 和应用。Date2重点与难点n重点核素示踪技术的原理n难点1、核素示踪技术的原理2、核素示踪实验的方法学3、常见的核素示踪技术的类型及原理Date3Introduction 概 述n放射性核素示踪技术是核医学诊断与研 究的方法学基础。 核医学任何诊断技 术和方法都是建立在示踪技术的基础之 上的。 没有示踪原理就没有核医学。Date4什么是示踪技术？ What is traci
2、ng technique?n什么是示踪？n什么是放射性核素示踪技术？Date51923年 Hevesy 212Pb植物不同部位铅含量32P磷在生物体内代谢 1952年 Hershey 32P、35S DNA遗传信息 1959年 Berson、Yalow RIA Meselson、Stahl DNA半保留复制RNA-DNA逆转录、遗传的三联密码、细胞 周期、微量物质测量等均离不开示踪技术。Date6第一节 核素示踪原理与设计Date7为什么用放射性核素作为示踪剂？为什么用放射性核素作为示踪剂？Date835S32P35S32P子代 分离蛋白质外 壳及DNA内核， 并测量放射性蛋白质外壳无 放射性
3、，DNA 上有放射性！DNA是遗传物质！Date9一、示踪原理（ Principle ）1、示踪剂与被示踪物的不可区分性（同 一性）n放射性核素或标记化合物（示踪剂）与相 对应的同位素和化合物（被示踪物）具有 相同的化学和生物学特性，同样参与转化 过程，因此基本上能够反映被研究物质的 行为。被标记的物质也能代表非标记物的 行为。Date102、示踪剂的可测性（可测性）n放射性核素能自发地放射出射线。利用 高灵敏度的仪器可对示踪剂进行精确的 定量、定位、定性探测。动态观察各种 物质在生物体内的量变规律。 一、示踪原理（ Principle ）Date11二、示踪实验设计要点1、科学选择示踪剂 2
4、、防止实验过程中的交叉污染 3、注意安全防护 4、妥善处理放射性废物Date121、科学选择示踪剂（1）半衰期 （2）辐射类型和射线能量 （3）示踪原子标记位置 （4）放射化学纯度 （5）放射性比活度Date13（1）半衰期根据实验周期，选择合适半衰期的放射性 核素。半衰期应足够长，以满足实验周期 的要求；同时又要足够短，以便于放射性 废物的处理。Date14（2）辐射类型和射线能量n辐射类型：射线发射体核素半衰期极长，毒性大， 射 线测量困难，通常很少用；射线和射线测量 较容易， 常采用。发射射线的核素通常用于体 外示踪实验；发射射线的核素则体内、体外示 踪实验均可使用；而体内示踪实验因射线
5、穿透 力强，多采用。n射线能量：在满足实验要求的情况下，尽可能用发射低能 射线的放射性核素，以方便防护。Date15（3）示踪原子标记位置n研究物质转运规律时，追踪观察的是示踪 物的去向，故只要求标记原子牢固即可。n而研究物质时，示踪原子的标记位置应固 定。如研究氨基酸脱羧基时，示踪原子应 标记在羧基上。Date16（4）放射化学纯度n为避免不同放射性示踪剂非标记物的干扰 ，减少对实验对象的不必要的照射，放射 性示踪剂的放射化学纯度应95%。Date17（5）放射比活度n由于示踪实验时，示踪剂被稀释，故原始的比活 度应足够高，才能满足测量要求。n原始比活度的可根据下式计算：ACE/D2BA：原
6、始比活度C：原始放射性示踪剂用量E：仪器的探测效率D：稀释倍数B：仪器的本底Date18n例：静脉注射示踪剂，被观察组织摄取该示踪剂的量约 占总量的1%，拟10天后取样，在此期间示踪剂从该 组织中消失约为摄入量的90%，取样约占该组织的 10%，仪器测量效率为50%，本底为125cpm。 计算：最少放射性dpm：125250%=500dpm取样时该组织的总dpm：50010%=5000dom初始时该组织的总dpm：5000（1-90%）1%=5106dpm初始引入的示踪剂用量：5106 60=83.8KBqDate192、防止实验过程中的交叉污染n实验室应按“三区”进行配置，进行放射性 操作的
7、器材不能与非放射性器材混用。n不同的标本应分开放置，防止放射性污染 ，导致实验结果不准确。Date203、注意安全防护n所有操作均需按放射性操作规程进行 ；放射性操作前应进行冷实验，以减 少不必要的照射。Date214、妥善处理放射性废物n示踪实验所产生的放射性废物，应分 类放置、储存，及时处理，防止对环 境造成污染和对人员的不必要照射。Date22三、核素示踪实验的特点n灵敏度高：标记物比放高，化学量小，作超微量 分析可达ngpg。n特异性强：每一种检测项目，都有专一的标记物 。n方法简便、准确性好：核射线的测量受外界、pH 、温度等条件影响小。n符合生理条件：体内核医学的各种检查，不干扰
8、机体内环境，对细胞代谢无损伤。n定性、定量、定位检测和研究：除超微量分析外 ，与电镜结合能进行亚细胞水平的定位分析。Date23第二节 放射性核素标记化合物预习，下次课讲授Date24第三节 相关核素示踪技术一、核素稀释法 二、放射自显影术 三、物质转化示踪技术 四、核酸探针标记技术 五、活化分析（单独讲授）（单独讲授）Date25一、核素稀释法1、基本原理根据化学物质稀释前后质量相等的原理， 即已知比活度为S1、质量为m1的标记物和 质量为m2的同一种化学形态的非标记物均 匀混合时，标记分子被非标记物稀释，混 合物的比活度S2比S1低，混合前后总放射 性相等。即：S2（m1+m2）=S1m1
9、若m2m1，则： S2m2=S1m1Date26n如分析对象为液体，以及稀释前后物质在 深液中的浓度基本不变，则可用放射性浓 度（如dpm/ml）代替放射性比活度，用稀 释前后的v代替质量m，则上式可写成：C2（v1+v2）=C1v1若C2C1，则：C2v2=C1v1Date272、正稀释法n用已知量的标记物为示踪剂来测定未 知量的非标记物的稀释法称为核素正 稀释法。n求m2（v2）Date28例1：n用放射性浓度为3106cpm/ml的125I-HSA1ml注入 一成人体内，待平衡后取静脉血1ml，测其放射性 浓度为500cpm/ml，问该人的血容量是多少？nC1= 3106cpm/ml v
10、1=1mlnC2=500cpm/ml 求v2？C2（v1+v2）=C1v1因C2C1，则：C2v2=C1v131061=500v2 v2=3106/500=6000mlDate29例2：n欲测蛋白质水解液中天冬氨酸的含量，将5mg比 活度为17kBq/mg的标记天冬氨酸加放水解液，混 匀后分离出一部分纯天冬氨酸，测得其比活度为 0.37kBq/mg，求该水解液中天冬氨酸的含量。nS1=17kBq/mg m1=5mgnS2=0.37kBq/mg m2？S2（m1+m2）=S1m10.37（5+m2）=175m2=225mg 225-5=220mg则该水解液中天冬氨酸的含量为220mg。Date3
11、02、反稀释法n用已知量的非标记物测定样品中标记物含 量的稀释方法。因标记特的量极微，或混有其他放射性杂质 ，直接测量无法准确获得标记物的量，故 加入已知的非标记物混匀后，测得放射性 ，运用公式：S2（m1+m2）=S1m1或C2（v1+v2） =C1v1，此时S1、S2、m2（C1、C2、v2） 已知，求的是m1（v1）。Date313、核素稀释法的优点n最大优点：不需待测物质定量回收。尤其 是以下情况（1）未知物质无法定量分离；（2）需要快速分析；（3）需分离的物质浓度很低；（4）测量整体分布容积。Date32三、物质转化示踪技术n示踪剂可以与被示踪特一样参与机体内的 运行、分布并参与机体
12、的各种转化、代谢 过程。n运用各种标记物前体，来判断前体与产物 之间的关系，如转化速度、转化部位、转 化所需条件、转化过程、转化影响因素等 。Date331、掺入实验*A时间P测量有放射性无放射性A是P的前体A不是P的前体*APB放射性依次出现A先转化成B，再由B转化为PDate34（1）主要技术参数1）掺入百分率（相对参入量）掺入百分率=产物放射性/前身物放射性100%2）相对比活度相对比活度=产物的比活度/前身物的比活度Date35（2）应用举例n3H-TdR 掺入3 3H-TdRH-TdRDNA淋巴细胞 转化实验机体免疫功能其他增殖 细胞实验细胞 周期细胞 增殖肿瘤细 胞实验LAK细胞活
13、性NK细胞活性肿瘤免疫+化疗药物肿瘤药敏Date362、微生物放射性测量14C-葡萄糖细菌 14CO2细菌快速诊断抗生素 细菌药敏6h出报告14C-尿素口服HP14CO2诊断胃HP感染2h出报告Date373、其他（1）物质吸收部位实验（45Ca吸收示踪实验） （2）物质在不同组织转运实验（Ca在血浆与 骨之间的交换；动脉脉粥样硬化斑块中胆固 醇来源等。） （3）生物膜两侧物质的转运（孕妇与胎儿通过 胎盘进行物质转运；细胞膜内外物质的转运 等。） （4）物质分布部位的研究Date38四、核酸探针标记技术在分子生物学中，放射性核素示踪技术起到 了十分重要的作用。当前，核酸序列分析 和核酸分子杂交
14、中最常用的示踪手段是放 射性核素示踪技术。尽管其他的非放射性 示踪技术进展迅速，但核素示踪技术仍是 其金标准，具有不可替代性。Date39核酸探针n核酸探针，一般指能与特定核苷酸序 列或基因序列的DNA片段或RNA片段发 生特异性互补结合的核苷酸片段，可 用于检测待测物中的核苷酸序列或基 因序列。n实验应用的探针必须使DNA或RNA分子 上带有可被探测的信号，最常用的是 放射性核素。Date401、核酸探针的分类（1）基因组DNA探针 （2）cDNA探针 （3）RNA探针 （4）寡核苷酸探针Date412、核酸探针的标记（1）DNA全链标记 （2）DNA末端标记 （3）RNA全链标记Date4
15、2（1）DNA全链标记1）缺口平 移法（用 于标记双 链DNA）3 55 3 DNA酶I Mg+双链DNA带切口的DNADNA聚合酶I -32P- dNTP32P标记的 单链DNA 片段 Date432）标记cDNAA、单链DNA探针的标记B、随机引物DNA标记C、RNA互补的cDNA标记Date44（2）DNA末端标记A、5末端标记法T4多核苷酸激酶、-32P-ATPB、3末端标记法Klenow酶、-32P-dNTPDate45（3）RNA的全链标记利用SP6RNA聚合酶，转录插入多克隆位点 的外源DNA。加入-32P-UTP即可制备高 比活的的RNADate46五、活化分析n利用粒子束照射样品，使其中待测稳定性 核素发生核反应，变为放射性核素，从而 对样品中的元素作定性和定量的超微量分 析方法。包括活化和分析两步骤。Date47活化分析的应用n活化分析灵敏度极高，主要通过测定各种 微量元素，进行生理、生化、药理、诊断 、病因、食品、法医和环境监测等方面研 究。Date48思考题1、何谓核素示踪技术，其原理和主要类型有哪 些？ 2、如何进行核素示踪实验的设计？ 3、简述3H-TdR掺入实验的原理及应用价值。 4、DNA缺口平移法和5末端标记法所需的酶和 放射性原料是什么？Date49
