实验六IPCR扩增技术

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1、实验六、PCR扩增技术 （8学时 ） 1. Taq 酶的特点和作用原理 2. PCR 体系的组成及其作用 3. PCR特异引物的设计 4. PCR 仪器的使用 5. PCR 反应的设置 6. PCR 结果的电泳检测 时间安排u 1、介绍PCR扩增技术的原理 u 2、转化子的菌落PCR筛选（此两步共4 学时） u 3、PCR 结果的电泳检测 u 4、转化子的酶切鉴定（此两步共4学时 ）PCR的定义： 在引物指导下由酶催化的对特定克隆或基 因组DNA序列进行的体外扩增反应。PCR的技术特点： 特异、敏感、产率高、快速、简便、重复 性好、易自动化等Kary B. Mullis (1944 -)，在

2、Cetus公司工作期间，发明 了PCR。 他原本是要合成 DNA引物来进行测序工作 ， 却常为没有足够多的模 板DNA而烦恼。1983年春 夏之交的一个晚上，他开车 去乡下别墅的路上萌发了用 两个两个引物（而不是一个引物 ）去扩增模板DNA 的想法 .很少有在公司工作的科研人员得很少有在公司工作的科研人员得 诺贝尔奖，诺贝尔奖， MullisMullis是其中之一是其中之一MullisMullis的第一个的第一个PCRPCR实验实验 1983年9月中旬。 MullisMullis在反应体系中在反应体系中 加入加入DNADNA聚合酶后在聚合酶后在37 37 一直保温。结一直保温。结 果第二天在琼

3、脂糖电泳上没有看到任何条果第二天在琼脂糖电泳上没有看到任何条 带。于是他认识到有必要用加热来解链，带。于是他认识到有必要用加热来解链， 每次解链后再加入每次解链后再加入DNADNA聚合酶进行反应，聚合酶进行反应， 依次循环。依次循环。 19831983年年1212月，他终于看到了月，他终于看到了 被同位素标记的被同位素标记的PCRPCR条带。条带。 PCR的发展史 1983年春，Mullis发展出PCR的概念； 1983年9月，Mullis用大肠杆菌DNA聚合酶做了第一个 PCR实验，只用一个循环； 1983年12月，用同位素标记法看到了10个循环后的49 bp 长度的第一个PCR片断； 19

4、85年12月20日，Mullis的同事Saiki在Science上发了一 篇论文，方法中用了PCR技术，导致Mullis的文章到处 被拒； 1985年10月25日申请了PCR的专利，1987年7月28日批 准（专利号4,683,202 ），这回Mullis是第一发明人。 1986年5月，Mullis在冷泉港实验室做专题报告，全世界 从此开始学习PCR的方法； 1986年6月，Cetus公司纯化了第一种高温菌DNA聚合酶 ，Taq DNA polymerase，这是85年春天Mullis建议做的 ； 1988年，第一台PCR仪问世； 1991年，Hoffman LaRoche以3亿美元的代价从C

5、etus公 司获得全权开发权。PCR技术原理 类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列 两端互补的寡核苷酸引物。分为三个基本步骤：模板DNA变性：加热至94左右，双链DNA解离成单链；模板DNA与引物的退火(复性)：将温度降至引物的Tm值 以下，3端与5端的引物各自与两条单链DNA模板 的互补区域通过氢键配对结合 ；引物的延伸：在Taq DNA聚合酶作用下，以dNTP为原料 ，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合 成一条新的双链；重复循环变性-退火-延伸三过程，使DNA扩增量呈指 数上升。 PCR的原理标准PCR反应体系10扩增缓冲液 10l4种dNTP混合物 各200mol

6、/L引物 10100 pmol模板DNA 0.12gTaq DNA聚合酶 2.5 u（Mg2+） 1.5 mmol/L加双或三蒸水至 100ulPCR反应五要素p 引物 （primer）p 酶 （Taq DNA polymerase） p dNTP （dATP,dGTP,dCTP,dTTP） p 模板 （template） p Mg2+ （magnesium）引物引物是PCR特异性反应的关键PCR 产物的特异性取决于引物与模板 DNA互补的程度引物包括正向（F）和反向（R）引物引物设计的原则1、引物长度：16-30个碱基，常为20个碱基左右。2、引物碱基组成：G+C含量以40-60%为宜, A

7、TGC最 好随机分布，尤其在3端不应存在连续3个G或 C,否则会使引物与核酸的G或C富集区错误互补， 而影响PCR的特异性。可按下式粗略估计引物的解链温度：Tm4(G+C)+2(A+T)。 4、避免引物内或引物间出现二级结构或引物间互补避免两引物间互补，特别是 3端 5、引物 3端的碱基要求严格配对 引物3端是引发延伸的点。因此不应错配。由于ATCG引起错配有一定规律，以 引物3端A影响最大，因此，尽量避免在引物3端第一位碱基是A。引物3 端也不要是编码密码子的第三个碱基，以免因为密码子第3位简并性而影响 扩增特异性。 6、引物5端对扩增特异性影响不大, 引物中可以加上合适的酶切位点以及标 记

8、生物素、荧光素、地高辛等 7、引物的特异性所扩增产物本身无稳定的二级结构, 以免产生非特异性扩增,影响产量。引物 与非特异靶区之间的同源性不要超过70或有连续8个互补碱基同源，否则 导致非特异性扩增。 8、两引物的Tm值接近9、简并引物应选用简并程度低的密码子例如选用只有一种密码子的Met, 3端应不存在简并性。否则可能由于产量低 而看不见扩增产物。dNTP 的质量与浓度dNTP使用注意：1)保存：使用时应配成高浓度（5-10 mmol/L） ，小量分装，-20冰冻保存。 多次冻融会使dNTP降解；2)使用量：在PCR反应中，dNTP终浓度应为 20-200umol/L。3)成分配比：注意4种

9、dNTP的浓度要相等；Mg2+的浓度1） Mg2+浓度对Taq DNA聚合酶影响很大Mg2+浓度过低，Taq酶活力显暑降低； Mg2+浓度过高，又使酶催化非特异性扩增。2）通常Mg2+浓度范围为0.5-2 mmol/L。 模板模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败 的关键环节之一。模板量过多则可能增 加非特异性产物。DNA中的杂质也会影 响PCR的效率。 Taq DNA聚合酶有很高的耐热稳定性。一般Taq DNA聚合酶活性 半衰期为92.5 130min, 95 40 min，97 5min。 Taq DNA聚合酶的酶活性单位定义为74下30 min，掺入10 nmol/L dNTP到核酸中所需

10、的酶量 。在100 l PCR反应中，1.5-2单位的Taq DNA 聚合酶就足以进行30轮循环。 纯化的Taq酶在体外无3-5外切酶活性，因而无 校正阅读功能，在扩增过程可引起错配。一般 PCR中出错率为210-4 核苷酸/每轮循环 。应用 低浓度的dNTP(各20 molL)、1.5mmol/L的 Mg2+浓度、高于55的复性温度，可提高Taq酶 的忠实性，此时的平均错配率仅为5x10-6次/每轮 循环 。 高保真的DNA聚合酶通常所用的PCR方法在两个方面都有局限性，扩 增片段的精确程度和合成片段的大小。 Pfu DNA聚合酶是一种热稳定性 DNA 聚合酶， 从携带pyrococcus

11、furiosus 的 pol 基因的大肠 杆菌中分离得到。该酶具有 3 到 5 校读外切酶 活性，其最适反应温度为 75 ，并且错误率极 低（ 大约是 Taq DNA 聚合酶的 8 倍 ）。 Pfu 是目前保真度较高的聚合酶。 PrimeSTAR DNA聚合酶是兼具高保真性和高扩 增效率的DNA 聚合酶。该酶具有 3 到 5 校读外 切酶活性。制品中添加了能在常温状态下抑制聚 合酶和外切酶活性的抗体，能有效防止PCR反应 前的引物错配和引物降解。灭活Taq DNA聚合酶的方法(1) PCR产物经酚：氯仿抽提，乙醇沉淀 。(2) 加入10 mmol/L的EDTA螯合Mg2+ 。(3) 99-10

12、0加热10 min。(4) 目前已有直接纯化PCR产物的Kit可用 。 反应缓冲液 反应缓冲液一般含10-50 mmol/L TrisCl (20 下pH8.3-8.8), 50 mmol/L KCl和适当浓度的 Mg2+ ，TrisCl在20时pH为8.3-8.8，但在实 际PCR反应中，pH为6.8-7.8、50mmol/L的 KCl有利于引物的退火。另外，反应液可加入5 mmol/L的二硫苏糖醇(DDT)或100 g/ml的牛血 清白蛋白(BSA)，它们可稳定酶活性，另外加入 T4噬菌体的基因32蛋白则对扩增较长的DNA片 段有利。 各种Taq DNA聚合酶商品都有自己特定的一些 缓冲液

13、。 PCR反应参数的设置p 温度p 时间p 循环次数设置温度与时间设置变性-退火-延伸三个温度点：标准反应中采用三温度点法：1）93-95变性；2）40-60退火；3）70-75延伸对于较短靶基因（长度为100300bp时）可采用 二温度点法， 一般采用94变性，65左右退 火与延伸变性的温度与时间在94下预变性2-5 min非常重要，它可使 模板DNA完全解链 。 一般变性温度与时间为94 1min。 变性不完全，往往使PCR失败，因为未变 性完全的DNA双链会很快复性，减少 DNA产量。 为防止在变性温度时反应液的蒸发，可在 反应管内加入1-2滴液体石蜡或PCR仪器 设置成热盖。 退火的温

14、度与时间引物退火的温度和所需时间的长短取决于引物 的碱基组成，引物的长度、引物与模板的配对 程度以及引物的浓度。实际使用的退火温度比 扩增引物的Tm值约低5。 退火温度越高, 所得产物的特异性越高。而退火 温度过低，易引起非特异性扩增。 退火一般仅需数秒钟即可完成，反应中所需时 间主要是为使整个反应体系达到合适的温度。 退火反应时间一般为1 min。 延伸的温度与时间 温度：一般7075，常用温度为72。 时间： 根据待扩增片段长度而定,1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min足够了。延伸时间过长会导致产物非特异性增加，但对很低浓度的目的序列, 则可适当增加延伸反应的时间。 一般在扩增反应完成

15、后,都需要一步较长时间(10- 30min)的延伸反应，以获得尽可能完整的产物, 这对以 后进行克隆或测序反应尤为重要。 循环次数 当其它参数确定之后, 循环次数主要取决于DNA浓 度。一般而言25-30轮循环已经足够。 平台期会使原先由于错配而产生的低浓度非特异性 产物继续大量扩增，达到较高水平。因此，应适当 调节循环次数，在平台期前结束反应， 减少非特 异性产物。 通常经25-30轮循环扩增后, 反应中Taq DNA聚合 酶已经不足, 如果此时产物量仍不够, 需要进一步扩 增, 可将扩增的DNA样品稀释103-105倍作为模板, 重新加入各种反应底物进行扩增。 PCR产物的克隆在许多研究中，需要将PCR产物克隆,以获得目的DNA片 段。通常将PCR产物插入到载体中有下列一些方法。 平末端连接由于Taq DNA聚合酶往往在PCR产物3端加上多余的 非模板依赖碱基，在用平末端连接克隆PCR产物前，可 用Klenow片段或T4 DNA聚合酶处理补平末端。 在PCR产物尾部加dT或ddTTaq DNA聚合酶会在3端加上多余的非模板依赖碱基， 而且对A优先聚合，所以PCR产物末端的多余碱基大部 分都是A，目前一些公司已开发出可直接用于克隆PCR 产物的带3-T的T-Vector。 粘