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1、SdsSds-page-page电泳培训资料电泳培训资料培训人：刘小强1.实验目的学习SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理。掌握垂直板电泳的操作方法。运用SDS-PAGE测定蛋白质分子量及染色鉴定2.实验原理带电质点在电场中向带有异相电荷的电极移动，这种现 象称为电泳。 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中 引进SDS（十二烷基磺酸钠）， SDS能断裂分子内和 分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂 能使半胱氨酸之间的二硫键断裂，蛋白质在一定浓度的 含有强还原剂的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合， 形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物，这种复合物由于 结合大量的S
2、DS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成 仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或 消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异，由于SDS 与蛋白质的结合是按重量成比例的，因此在进行电泳时 ，蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小。3.实验试剂水：当天纯化水A液：B液：C液：1%SDS(要配置成10%的母液)D液：E液：10%AP:F液：TEMED染色液：考马斯亮蓝（先用50ML的乙酸溶解再加甲醇和水）脱色液：50ML的乙酸+200ML的甲醇+250ML水4.器材JUNYI-1600电源BOI-RAD电泳槽 5.技术参数250V电压浓缩胶使用15MA电流（每块胶），分离胶使 用30MA电流电泳时
3、间：在溴酚蓝跑到浓缩胶和分离胶交界 的地方调高电流继续电泳，等溴酚蓝跑的玻璃 板底部停止。6.制胶将玻璃板用蒸馏水洗净晾干 把玻璃板在灌胶支架上固定好. 固定玻璃板时，两边用力一定要均匀，防止夹坏玻璃板.按比例配好分离胶,用移液管快速加入 + 凝胶配制过程要迅速, 催化剂TEMED要在注胶前再加入,否则 凝结无法注胶.注胶过程最好一次性完成,避免产生气泡. +水封的目的是为了使分离胶上延平直，并排除气泡凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面. 倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干,按比例配好浓缩胶,连续平稳 加入浓缩胶至离边缘5mm处,迅速插入样梳,静置40分钟.样梳需一次平稳插入,梳口处不得
4、有气泡,梳底需水平.7.样品处理把样品稀释到合适浓度，按样品和样品缓 冲液3:1的比例加入MARKER 10UL水+1ULMARKER+5UL还 原BAFFUR沸水煮5分钟，离心8000RPM/5分钟，然后 上样8.凝胶板剥离与染色：电泳结束后，撬开玻 璃板，将凝胶板做好标记后放在塑料盒内 ，加入染色液，染色过夜。 脱色：染色后的凝胶，弃掉染色液，加入 脱色液在摇床上再脱色，直到蛋白质区带 清晰。剥胶时要小心,保持胶完好无损,染色要充 分. 实验结果分析：凝胶成像系统SDS-PAGE电泳过程中影响结果的因素： 1. 配胶缓冲液系统对电泳的影响？ 在SDSPAGE不连续电泳中，制胶缓冲液使用的是
5、TrisHCL 缓冲系统，浓缩胶是pH6.7，分离胶pH8.9；而电泳缓冲液使用 的Tris甘氨酸缓冲系统。在浓缩胶中，其pH环境呈弱酸性， 因此甘氨酸解离很少，其在电场的作用下，泳动效率低；而CL 离子却很高，两者之间形成导电性较低的区带，蛋白分子就介 于二者之间泳动。由于导电性与电场强度成反比，这一区带便 形成了较高的电压剃度，压着蛋白质分子聚集到一起，浓缩为 一狭窄的区带。当样品进入分离胶后，由于胶中pH的增加，呈 碱性，甘氨酸大量解离，泳动速率增加，直接紧随氯离子之后 ，同时由于分离胶孔径的缩小，在电场的作用下，蛋白分子根 据其固有的带电性和分子大小进行分离。 所以，pH对整个反应体系
6、的影响是至关重要的，实验中在排除 其他因素之后仍不能很好解决问题的情况，应首要考虑该因 素。 +2. 样品如何处理？ 根据样品分离目的不同，主要有三种处理方法：还原SDS处 理、非还原SDS处理、带有烷基化作用的还原SDS处理。 1）还原SDS处理：在上样buffer中加入SDS和DTT（或Beta巯 基乙醇）后，蛋白质构象被解离，电荷被中和，形成SDS与蛋 白相结合的分子，在电泳中，只根据分子量来分离。一般电泳 均按这种方式处理，样品稀释适当浓度，加入上样Buffer，离 心，沸水煮5min，再离心加样。 2）带有烷基化作用的还原SDS处理：碘乙酸胺的烷基化作用 可以很好的并经久牢固的保护S
7、H基团，得到较窄的谱带；另碘 乙酸胺可捕集过量的DTT，而防止银染时的纹理现象。100ul样 品缓冲液中10ul 20的碘乙酸胺，并在室温保温30min。 3）非还原SDS处理：生理体液、血清、尿素等样品，一般只 用1SDS沸水中煮3min，未加还原剂，因而蛋白折叠未被破 坏，不可作为测定分子量来使用。+3. SDS-PAGE电泳凝胶中各主要成分的作用？ 聚丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺与为蛋白质电泳提供载体，其凝 固的好坏直接关系到电泳成功与否，与促凝剂及环境密切相关 ； 制胶缓冲液：浓缩胶选择pH6.7，分离胶选择pH8.9，选择tris HCL系统，TEMED与AP：AP提供自由基，TEMED
8、是催化 剂，催化自由基引起的聚合反应进行；十二烷基硫酸钠（SDS ）：阳离子去污剂，作用有四：去蛋白质电荷、解离蛋白质之 间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠。 4. 提高SDS-PAGE电泳分辨率的途径？ 聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝胶的分辨率。建议做法：待 凝胶在室温凝固后，可在室温下放置一段时间使用。忌即配即 用或4度冰箱放置，前者易导致凝固不充分，后者可导致SDS 结晶。一般凝胶可在室温下保存4天，SDS可水解聚丙烯酰 胺。 一般常用的有氨基黑、考马斯亮蓝、银染色三种染料，不同染 料又各自不同的染色方法，具体可参照郭尧君编著的蛋白质 电泳技术手册P82-103。 +5.“
9、微笑”（两边翘起中间凹下）形带原因？ 主要是由于凝胶的中间部分凝固不均匀所致，多出现于较厚的 凝胶中。 处理办法：待其充分凝固再作后续实验。 6. “皱眉”（两边向下中间鼓起）形带原因？ 主要出现在蛋白质垂直电泳槽中，一般是两板之间的底部间隙 气泡未排除干净。 处理办法：可在两板间加入适量缓冲液，以排除气泡。 7. 为什么带出现拖尾现象？ 主要是样品融解效果不佳或分离胶浓度过大引起的。 处理办法：加样前离心；选择适当的样品缓冲液，加适量样品 促溶剂；电泳缓冲液时间过长，重新配制；降低凝胶浓度。 8. 为什么带出现纹理现象？ 主要是样品不溶性颗粒引起的。 处理办法：加样前离心；加适量样品促溶剂。
10、+9. 什么是“鬼带”，如何处理？ “鬼带”就是在跑大分子构象复杂的蛋白质分子时，常会出现在泳道顶 端（有时在浓缩胶中）的一些大分子未知条带或加样孔底部有沉淀， 主要由于还原剂在加热的过程中被氧化而失去活性，致使原来被解离 的蛋白质分子重新折叠结合和亚基重新缔合，聚合成大分子，其分子 量要比目标条带大，有时不能进入分离胶。但它却于目标条带有相同 的免疫学活性，在WB反应中可见其能与目标条带对应的抗体作用。 处理办法：在加热煮沸后，再添加适量的DTT或Beta巯基乙醇，以补 充不足的还原剂；或可加适量EDTA来阻止还原剂的氧化。 10. 为什么溴酚蓝不能起到指示作用？ 我们在实验中常会遇到溴酚蓝
11、已跑出板底，但蛋白质却还未跑下来的 现象。主要与缓冲液和分离胶的浓度有关。 处理办法：更换正确pH值的Buffer；降低分离胶的浓度。 11. 为什么电泳的条带很粗？ 电泳中条带很粗是常见的事，主要是未浓缩好的原因。 处理办法：适当增加浓缩胶的长度；保证浓缩胶贮液的pH正确（6.7 ）；适当降低电压； +12. 为什么电泳电压很高而电流却很低呢？ 这种现象一般初学者易出现。比如电压50v以上，可电流却在5mA以下。主要 是由于电泳槽没有正确装配，电流未形成通路。包括：a.内外槽装反；b.外槽 液过少；c.电泳槽底部的绝缘体未去掉（比如倒胶用的橡胶皮）。 处理办法：电泳槽正确装配即可。 13.
12、浓缩胶与分离胶断裂、板间有气泡对电泳有影响吗？ 这主要出现在初学者中，一般对电泳不会有太大的影响。前者主要原因是拔 梳子用力不均匀或过猛所致；后者是由于在解除制胶的夹子后，板未压紧而 致空气进入引起的。 14. 凝胶时间不对，或慢或快，怎么回事？ 通常胶在30MIN-1H内凝。如果凝的太慢，可能是TEMED，APS剂量不够或 者失效。APS应该现配现用，TEMED不稳定，易被氧化成黄色。 如果凝的 太快，可能是APS和TEMED用量过多，此时胶太硬易裂，电泳时易烧胶。 15. 电泳时间比正常要长？ 可能由于凝胶缓冲系统和电级缓冲系统地PH选择错误，即缓冲系统地PH和 被分离物质的等电点差别太小
13、，或缓冲系统的离子强度太高。 + +思考题： +在不连续体系SDS-PAGE中,当分离胶加完后,需在其上加一层 水,为什么? +电极缓冲液中甘氨酸的作用? +SDS-PAGE中样品液和浓缩胶选TRIS/HCL缓冲液，电极液选 TRIS/甘氨酸，电泳开始后，HCL解离成氯离子，甘氨酸解离出 少量的甘氨酸根离子。蛋白质带负电荷，因此一起向正极移动 ，其中氯离子最快，甘氨酸根离子最慢，蛋白居中。电泳开始 时氯离子泳动率最大，超过蛋白，因此在后面形成低电导区， 而电场强度与低电导区成反比，因而产生较高的电场强度，使 蛋白和甘氨酸根离子迅速移动，形成以稳定的界面，使蛋白聚 集在移动界面附近，浓缩成一中间层。 + +在不连续体系SDS-PAGE中,分离胶与浓缩胶中均含有TEMED 和AP,试述其作用?
