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1、第七章 现代技术与动植物检疫第一节 现代生物技术及其在动植物检疫中的应用 第二节 现代信息技术及其在动植物检疫中的应用第一节现代生物技术及其在动植物检疫 中的应用 现代生物技术为人类进一步认知自然现象，揭示自然规律提供了新的方法和工具。现代生物技术，特别是免疫学技术和分子生物学技术的广泛应用，促进了动植物检疫的进步。现代生物技术的组成 现代生物技术以现代生物学作为理论基础 ，由生物学、免疫学、化学、物理学、信 息学等多种学科理论和技术相互交叉融合 而成，其发展与材料、信息、传感器、图 像处理、微机电系统等多种技术的发展息 息相关，因而现代生物技术已经突破传统 生物学的范畴，成为研究现代生物学的
2、必 备工具和重要手段。现代生物技术的内容 现代生物技术涉及的内容非常广泛，如对 目的基因进行体外操作的基因克隆技术； 对生物的遗传基因进行改造或重组后产生 人类所需新物质的转基因技术；利用生物 反应器大量加工、制造生物活性产品的生 物发酵技术；将生物分子与电学、光学或 机械系统连接起来，并把生物分子捕获的 信息经放大、传递、转换后成为易于检测 的光、电或机械信息的生物耦合技术等。现代生物技术的特点1、突破物种界限，有效地改造生物有机体的遗传本 质； 2、现代生物技术带来的经济效益和社会效益日益显 著。 现代生物技术的广泛应用，给动植物检疫带来深刻的影响，特别是免疫学技术和分子生物学技术免疫学技
3、术和分子生物学技术的应用，使管制性动植物疫病的诊断和检疫水平得到极大的提高。一、免疫血清学技术基础 根据反应组分的不同可分为两大类：一是抗原和抗体参与的免疫血清学技术；二是免疫组织、细胞或分子参与的细胞免疫学技术。 其中免疫血清学技术在动植物检疫中应用最广泛，主要包括中和试验、凝集试验、沉淀试验、补体结合试验、免疫荧光抗体技术、放射免疫技术、免疫酶标记技术、胶体金标记技术、免疫电镜技术、免疫转印技术等。中和试验(neutralization test) 针对病毒的特异性抗体对病毒具有中和作用，利用这一特性，可以进行病毒感染的血清学诊断、病毒鉴定与毒株分型等。中和试验具有高度的特异性和敏感性，根
4、据病毒感染的宿主不同，中和试验可在实验动物、鸡胚或细胞上进行。例：中和试验检测猪瘟疫苗 A.正常细胞；B.标准阴性血清(40稀释)；C.标准阳性血清 (40稀释)；D.1号免疫前血清5稀释；E.1号免疫后血清 25稀释；F.4号免疫前血清7.5稀释；G.4号免疫后血清 35稀释；H.6号免疫前血清5稀释；I.6号免疫后血清5 稀释 凝集试验(agglutination test) 直接凝集试验：细菌等颗粒性抗原与相应抗体作 用后可出现肉眼可见的凝集现象，该方法简单快 速，可在玻片或试管内进行，对某些细菌病的诊 断非常有用，可用于检测抗体或鉴定细菌。 间接凝集试验：即将可溶性抗原或抗体首先吸附
5、在载体颗粒如红细胞、乳胶等表面，然后在适宜 电解质存在下与相应抗体或抗原反应形成肉眼可 见的凝集现象。方法简单快速，既可检测抗原又 可检测抗体，可制备成检测试剂盒应用于现场。 根据载体颗粒的不同可分为间接血凝试验、乳胶 凝集试验等。例：凝集试验 结果观察：将反应板倾斜成45 度角，沉于孔底的红细胞沿着 倾斜面向下呈线状流动者为沉 淀，表明红细胞未被或不完全 被病毒凝集；如果孔底的红细 胞铺平孔底，凝成均匀薄层， 倾斜后红细胞不流动，说明红 细胞被病毒所凝集。能使鸡红 细胞完全凝集的抗原的最高稀 释倍数，称为该抗原滴度红细 胞凝集效价。即沉淀的前一孔 即为该抗原的效价。如彩图1 所示第8孔红细胞
6、为完全凝集 ，说明该抗原效价为1：256。 沉淀反应 可溶性抗原与相应抗体结合所发生的沉淀 反应 环状沉淀试验 琼脂扩散试验 火箭免疫电泳 免疫电泳 补体结合试验 当可溶性抗原与相应抗体结合后，抗原一抗体复合物与补体结合，此反应肉眼无法判定，需要加入指示系统(如溶血系统)间接反映抗原和抗体的结合情况。因而该试验 包括两个系统：检测检测 系统统(抗原+抗体+补体)和溶血系统统(绵羊红细 胞+溶血素+补体)，两个系统通过竞 争共用的补体来反映抗原和抗体是否结合，若不出现溶血表明抗原和抗体发生特异性结合，反之出现溶血表明检测 系统中抗原和抗体不相对应 ，从而进行特异性抗原和抗体的定性或定量。由于本试
7、验 具有稳定、特异性高、重复性好的优点，因而成为一种常用的实验 室诊断方法。免疫荧光抗体技术 利用荧光色素如异硫氰氰酸荧荧光素(FITC)等标记抗 体或抗原，然后与相应抗原或抗体进行反应，由 于荧光色素在荧光显微镜的紫外光或蓝紫光的照 射下可激发出可见的荧光，从而间接证明抗体和 抗原是否结合。 该技术具有抗原抗体反应的特异性和染色技术简 单快速的特点，同时可在细胞水平上进行抗原定 位，因而在疫病诊断中得到广泛的应用，有直接 法和间接法。目前已有多种商品化的标记荧 光抗 体。放射免疫技术(RIA) 利用放射性同位素如3H、14C、131I、125I等标记已知的抗体或抗原，用于检测待检材料中的抗原
8、或抗体，然后根据抗原抗体复合物中同位素放射性的强度进行定性或定量测定。本技术将放射性同位素的高度敏感性和抗原抗体反应的特异性结合起来，因而具有其他检测技术无法比拟的敏感性和特异性。免疫酶标记技术 利用酶如辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酶(AP) 标记已知的抗体或抗原，用于检测待检材料中的抗 原或抗体，抗原抗体复合物中的酶在其底物存在时 可催化底物生成有色产物，根据有色产物的颜色深 浅间接反应抗原和抗体的结合情况。该技术将酶催 化反应的高度敏感性和抗原抗体反应的特异性相结 合，具有高度特异性和敏感性，不需特殊设备，在 动植物疫病检疫与诊断中广泛应用。 目前已有多种商品化的ELISA检测试剂盒
9、。胶体金标记技术 将胶体金作为载体吸附抗原或抗体，即为 胶体金标记物，此标记物与相应的抗体或 抗原反应后可形成肉眼可见的凝集现象， 因而可用于抗原或抗体的检测。该法简便 快速，反应结果呈红色，易于判定。可做 成诊断试纸条，应用十分方便。 免疫电镜技术(IEM) 将电镜的高分辨率与抗原抗体的特异性反 应相结合而建立的一种检测技术。此技术 可进行抗原定位和病毒样品的检测。免疫转印技术(Immunoblotting) 又称蛋白质印迹或Western Blotting，是将 蛋白质凝胶电泳、膜转印技术和抗原抗体 反应相结合而建立的一种检测技术。首先 将待检蛋白样品进行SDS一聚丙烯酰胺凝 胶电泳，根据
10、分子量大小分成不同区带， 然后转印至硝酸纤维素滤膜上，再与抗体 和标记二抗进行反应，从而可检测不同大 小的蛋白抗原。免疫沉淀技术(Immunoprecipitation) 将放射性同位素标记、免疫沉淀、SDS一聚丙烯 酰胺凝胶电泳和放射性自显影技术相结合而建立 的一种检测技术。 基本过程包括：在病毒增殖过程中加入放射性同 位素标记病毒蛋白，收获后加入特异性抗体和带 SPA的金黄色葡萄球菌，通过离心收集病毒一抗 体一葡萄球菌复合物，经热处理后收集病毒，进 行SDS一聚丙烯酰胺凝胶电泳，最后进行放射自 显影可得出检测结果。 二、分子生物学技术基础 分子生物学技术的飞速发展使动植物疫病 的诊断和检疫
11、迈上了一个新台阶。愈来愈 多的疫病建立了更加敏感特异的分子生物 学诊断技术，动植物疫病的诊断和检疫进 入了对病原基因序列和结构进行直接测定 的分子生物学水平。主要分子生物学诊断技术 聚合酶链式反应（PCR）、 核酸杂交、 寡核苷酸指纹图谱、 限制性片段长度多态性、 随机扩增多态性DNA、 脉冲电场凝胶电泳、 DNA序列测定、 DNA芯片、 DNA生物传感器等。其中，PCR和核酸杂交技术具有特异、敏感、快速、 适于疫病早期诊断和大量样品的检测而成为分子生物学诊 断技术中最常用和最具应用价值的方法。聚合酶链式反应(PCR)在体外利用耐热DNA聚合酶将少量DNA片段短时间内扩增数百万倍的一种方法。其
12、反应的基本原理和步骤包括：模板DNA高温变性成单链-72 下将单核苷酸从引物3端引入，沿模板5-3方向延伸，合成新的DNA 双链作为下次循环的模板-如此以指数方式增加，经约30个循环 使最初的模板DNA扩增数百万倍。PCR方法具有操作简便快速、灵敏度高、特异性强、对检测材料要求低等优点而得到广泛的应用。目前在常规PCR方法的基础上根据应用目的不同又衍生出一系列改良 PCR方法，包括反转录PCR(RTPCR)、套式PCR(Nested PCR)、 多重PCR(Multiplex，PCR)、实时荧光定量PCR(Real一time fluorescent quantitative，PCR)、兼并引物
13、PCR(Degenerate primer ，PCR)、免疫PCR(Immune，PCR)等。核酸杂交(Nuclear hybridization) 基本原理为碱基互补的两条单链核酸经退火后形成双链。 用于诊断目的的杂交双方是已知序列的标记探针和待检测 样品中的核酸。 标记的核酸探针必须具有高度特异性，通常用检测病原的 特异序列核酸片段进行标记。核酸探针的种类包括基因组 DNA探针、eDNA探针、RNA探针和寡核苷酸探针。 标记物主要有放射性标记物(如32P)和非放射性标记物(如 地高辛)。核酸杂交具有敏感、特异、可同时检测大量样 品的优点，因而在疫病诊断和检疫中也得到广泛应用。 根据核酸性质
14、和支持介质的不同，主要有点杂交(Dot blotting)、DNA印迹杂交(Southern blotting)、RNA印迹杂 交(Northern blotting)、原位杂交(In situ hybridization)。 寡核苷酸指纹图(Oligonucleotide fingerprinting) 该技术主要用于RNA病毒分析。其原理是 将提纯的病毒RNA，通过T1核糖核酸酶酶 切，产生大小不同的片段，经放射性同位 素标记后，进行垂直双相电泳，再经放射 自显影获得特征性的图谱。该技术可很好 地区别同一血清型或亚型的不同分离株， 并可对病毒核苷酸序列进行半定量比较， 因而对容易出现变异的
15、病毒鉴定很有价值 ，尤其是在鉴定新出现或重新出现的病毒 株上有很重要的应用价值。 限制性片段长度多态性(Restriction fragment length polymorphism。RFLP) 是将限制性内切酶、核酸电泳、印迹技术 和杂交技术相结合而建立的一种检测技术 。首先利用限制性内切酶消化DNA，通过 凝胶电泳形成酶切图谱，然后转印至膜上 ，利用制备的探针进行杂交，从而鉴定出 不同生物间的关系。该方法具有稳定性好 、敏感性高，可进行同种内不同个体的鉴 别。 随机扩增多态性（RAPD) 该技术应用一个随机引物(通常10个碱基)对 待检测DNA进行非特异性地扩增DNA片段 ，然后在凝胶电
16、泳上观察扩增片段。该法 操作简单，不需设计特异引物，用一个引 物即可扩增出一系列片段，适于对未知 DNA序列的基因组进行分析。但本法重复 性稍差。脉冲电场凝胶电泳(PFGE) 该技术是20世纪80年代中期发展起来的一种新的 电泳技术，主要用于大分子DNA的分离，其分辨 范围达到10 Mb，而普通的琼脂糖凝胶电泳仅能 分离小于50 kb的DNA分子。其基本原理是通过电 场的不断改变，使包埋在琼脂糖凝胶中的DNA分 子的泳动方向做相应改变，小的DNA分子比大的 变形快，故小分子泳动得快，从而在凝胶上按染 色体大小呈现出电泳带型。用PFGE可获得染色 体的数目及大小、基因组结构方面的基本数据。DNA序列测定(DNA sequencing) 所有基于核酸序列的分子生物学诊断方法 均根据DNA序列的差异而设计，因而DNA 序列测定是最好的检测方法。自Sa
