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1、 蛋白质是生命活动不可缺少的物质。随着人类基 因组计划的进展以及多种生物基因组测序工作的完成 ，人类跨入了后基因组和蛋白质组时代。对蛋白质的研究与应用，首先需要获得纯度较高 的蛋白质。因此，从复杂的细胞混合物中提取、分离 高纯度的蛋白质是生物科学研究中经常要做的工作。血红蛋白是人和其他脊椎动物红细胞的主要组成 成分，负责血液中O2和CO2的运输。在本课题中，我们将以血红蛋白为实验材料，学 习蛋白质提取和分离的一些基本技术。阅读教材P6466，找出下列内容：蛋白质提取和分离原理是什么 ？ 蛋白质提取和分离的方法有哪些？ 什么是凝胶色谱法？ 什么是凝胶电泳法？ 缓冲溶液的作用是什么？一、蛋白质提取
2、和分离原理：根据蛋白质的物理化学性质差异。如：1.分子的形状、大小2.电荷性质和多少3.溶解度 4.吸附性质5.对其他分子亲和力 二、蛋白质提取和分离的方法 ： 提取 分离 方法凝胶色谱法 凝胶电泳法 1、凝胶色谱法 （4）原理 ：（1）概念 ：（3）材料及材料特点（2）别名 ：（5）过程 ：阅读P64教材内容，回答相关问题 ：_法1、凝胶色谱法 （4）原理 ：凝胶是微小的多孔球体，大多数由多糖类化合物组 成，如葡聚糖或琼脂糖，内部有许多贯穿的通道。根据_的大小分离蛋白质的 有效方法（1）概念 ：（3）材料及材料特点分配色谱（2）别名 ：当_的蛋白质通过凝胶时，容易 进入凝胶内部的通道，路程_
3、 ，移动速度_， 而_的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只 能在_移动，路程_，移动速 度_ ，相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离 。 相对分子质量分子量小 长慢 分子量大 短 快凝胶颗粒的外部间隙混合物 上 柱洗 脱大分子流动快 小分子流动慢收 集 大分子收 集 小分子 （4）凝胶色谱法具体过程：洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液 ，促使蛋白质分子的差速流动。（5）凝胶色谱法动画 ：（3）常用的电泳方法 ：阅读P65教材内容，回答相关问题 ：（1）电泳概念：（2）凝胶电泳法原理：2凝胶电泳法：（4）实例 ：（1）电泳 ：（2）凝胶电泳法原理：2凝胶电泳法：许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都
4、具许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具 有可解离的基团，在一定的有可解离的基团，在一定的PHPH下，这些基团会下，这些基团会 带上正电或负电带上正电或负电在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所 带电荷带电荷_的电极移动的电极移动电泳利用了待分离样品中各种分子电泳利用了待分离样品中各种分子_ 的差异以及分子本身的的差异以及分子本身的_， _的不同使的不同使 带电分子产生不同的带电分子产生不同的_，从而实现样品，从而实现样品 中各种分子的分离中各种分子的分离_在电场的作用下发生迁移的过程带电粒子相反相反带电性质带电性质 大小大小形状形状 迁移速度迁移速
5、度（3）常用方法 ：琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳2凝胶电泳法：SDS（十二烷基硫酸钠）十二烷基硫酸钠）-聚丙烯酰胺凝胶电泳 测定蛋白质分子量（4）实例 ：原理原理 ：SDSSDS作用作用 ：蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决 于它所带于它所带净电荷的多少净电荷的多少以及以及分子的大小分子的大小等因素等因素为了消除为了消除静电荷对迁移率的影响，静电荷对迁移率的影响，可以可以 在凝胶中加入在凝胶中加入SDSSDS。它能与各种蛋白质形成蛋白质它能与各种蛋白质形成蛋白质 SDSSDS复合物，复合物，SDSSDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质所带负电荷的量大大
6、超过了蛋白质 分子原有电荷量。因而掩盖了不同种蛋白质间的电分子原有电荷量。因而掩盖了不同种蛋白质间的电 荷差别，荷差别， 使电泳迁移率使电泳迁移率完全取决于分子的大小完全取决于分子的大小（4）凝胶电泳原理示意图影响蛋白质分子运动速度的因素决定 运动方向电场 作用力形成 阻力决定 运动速率电电荷性 质质 电电荷量 分子形状 分子大小三、缓冲溶液1作用：2缓冲溶液的配制：使用比例使用比例能够抵制_对溶液的_ 的影响，维持PH基本不变。 外界的酸或碱外界的酸或碱PHPH值值通常由_缓缓冲剂剂溶解于水中配制而成 。调节缓调节缓 冲剂剂的_就可以制得 在不同pH范围围内使用的缓缓冲液。12种2 2、在血
7、红蛋白整个实验中用的缓冲液是、在血红蛋白整个实验中用的缓冲液是 什么？它的目的是什么？什么？它的目的是什么？ 使用的是磷酸缓冲液，目的是利用缓冲液使用的是磷酸缓冲液，目的是利用缓冲液 模拟细胞内的模拟细胞内的PHPH环境，保证血红蛋白的环境，保证血红蛋白的 正常结构和功能，便于观察正常结构和功能，便于观察( (红色红色) )和科学和科学 研究研究( (活性活性) )1、你知道的人体血液中的缓冲对有哪些？ 缓冲溶液由弱酸和相应的强碱弱酸盐溶解 于水中组成。 人体血液中的缓冲对有 H2CO3/NaHCO3，NaH2PO4/Na2HPO4等阅读P6669教材内容，回答相关 问题：一、蛋白质的提取和分
8、离一般分为哪些基本步骤？ 二、从红细胞中分离出血红蛋白的流程有哪些环节？ 三、血红蛋白的进一步纯化用什么方法？包括哪些步骤？ 四、进行蛋白质纯度的鉴定使用最多的方法是什么？一、蛋白质的提取和分离一般分为哪些基本步骤？ 蛋白质的提取和分离一般分为：样品处理、 粗分离、纯化、纯度鉴定等几个步骤。是否所有种类的蛋白质的提取和分离都是这 样的？为什么？ 不是 。你认为鸟类血液和哺乳动物血液中，最好哪种血 液来提取血红蛋白？为什么？ 因为蛋白质的来源和性质不同，分离方法差别很大 最好选用哺乳动物血液。因为该细胞中没有细胞 核，血红蛋白含量高。血液组成成分1. 血液由_和_两部分组成。2. 血细胞中_细胞
9、数量最多，细胞中含量 最高的化合物是_。 3. 该化合物是由 _和_构 成的，其中每个亚基中都含有一个能与O2和CO2 结合的_基团。血浆血细胞红细胞 血红蛋白2条-肽链2条-肽链 亚铁血红素二、从红细胞中提取和分离血红蛋白的流程样品处理 及粗分离纯 化纯度鉴定1.洗 涤 红 细 胞 2.释放血红蛋白 3.分离血红蛋白 4.透析血红蛋白1.凝胶色谱柱的制作 2.凝胶色谱柱的装填 3.样品的加入和洗脱 二、从红细胞中提取和分离血红蛋白的流程（一）样品处理及粗分离 1.洗涤红细胞 目的 ：方法 ：洗涤干净的标志 ：去除 _上清液没有黄色杂蛋白，以利于后续步骤的分离纯化 血液 100mL3g柠檬酸钠
10、低速离心 2 min红细胞血 浆吸出血浆红细胞5倍体积生理盐水搅拌 10min重复洗涤3次加入物质及操作目的分析： 1. 蒸馏水的作用是_。 2. 加入甲苯的作用是_。 3. 充分搅拌的目的是_。使红细胞大量吸水胀裂 溶解红细胞的细胞膜 加速红细胞的破裂二、从红细胞中提取和分离血红蛋白的流程（一）样品处理及粗分离 2.释放血红蛋白释放血红蛋白过程中，在洗涤好的红细胞 中加入了哪些物质？ 加入了蒸馏水、甲苯 二、从红细胞中提取和分离血红蛋白的流程 （一）样品处理及粗分离 3.分离血红蛋白将搅拌好的混合液转移到离心管内，以 2000r/min的速度离心10 min ，试管中的 溶液分为4层:最上层
11、： _的甲苯层 第2层： _的沉淀层，_色薄层固体 第3层：_ 的水溶液层， _的液体 最下层：其它杂质的_沉淀层阅读P67教材内容，回答相关问题 ：无色透明 脂容性物质白 血红蛋白红色透明 暗红色滤纸过滤脂类物质分离过程图解红细胞 混合液高速离心 10min 离心 管烧杯有机溶剂血红蛋白二、从红细胞中提取和分离血红蛋白的流程（一）样品处理及粗分离 3.分离血红蛋白去除血红蛋白中的小分子杂质二、从红细胞中提取和分离血红蛋白的流程 （一）样品处理及粗分离 4.透析血红蛋白透析的目的 ：透析袋的材料及特性：硝酸纤维素；半透性透析液及作用：pH7的磷酸缓冲液 ；维持血 红蛋白的正常特性 透析的过程
12、：阅读P67教材内容，思考问题：20mmol/L磷酸缓冲液1mL1mL1mL二、从红细胞中提取和分离血红蛋白的流程 （一）样品处理及粗分离 4.透析血红蛋白透析的过程 ：12h300mL二、从红细胞中提取和分离血红蛋白的流程（二）血红蛋白的纯化凝胶色谱操作阅读P6769教材内容，思考问题 ：凝胶色谱分离蛋白质包括哪几个步骤？ 凝胶色谱柱装填使用的材料和方法步骤是什么？凝胶色谱柱装填的注意事项？二、从红细胞中提取和分离血红蛋白的流程（二）血红蛋白的纯化凝胶色谱操作凝胶色谱分离蛋白质包括：凝胶色谱柱装填使用的材料：1、制作色谱谱柱； 2、装填色谱谱柱； 3、样样品加入和洗脱交联葡聚糖凝胶G-75二
13、、从红细胞中提取和分离血红蛋白的流程（二）血红蛋白的纯化凝胶色谱操作2、凝胶色谱柱装填的方法步骤：步骤骤操作要求 立刻用磷酸缓冲液洗涤平衡12h洗涤平衡一次性缓慢倒入；轻轻敲打装填悬浮液凝胶颗粒蒸馏水充分溶胀根据色谱柱体积计算凝胶用量色谱柱垂直固定在支架上配制悬浮液计算称量凝胶固定色谱柱二、从红细胞中提取和分离血红蛋白的流程（二）血红蛋白的纯化凝胶色谱操作凝胶色谱柱装填的注意事项： 装填尽量紧密，降低颗粒间隙； 无气泡(气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱 次序，降低分离效果)； 洗脱液不能断流(平衡凝胶使凝胶装填紧密) 。 二、从红细胞中提取和分离血红蛋白的流程（二）血红蛋白的纯化凝胶色谱操作3、
14、样品的加入和洗脱阅读P6869教材内容，了解加样 和洗脱的步骤a加样前，打开流出口， 使柱内凝胶面上的_ 缓慢下降到与_ 平齐，关闭出口。缓冲液 凝胶面二、从红细胞中提取和分离血红蛋白的流程（二）血红蛋白的纯化凝胶色谱操作3、样品的加入和洗脱加样二、从红细胞中提取和分离血红蛋白的流程 （二）血红蛋白的纯化凝胶色谱操作 3、样品的加入和洗脱b加样 时，用 _小心 地将1mL 透析后的 样品加到 _的 顶端，注 意不要破 坏_ 。吸管色谱柱凝胶面加样c加样后，打开 下端出口，使样品 渗入_内。凝胶层二、从红细胞中提取和分离血红蛋白的流程（二）血红蛋白的纯化凝胶色谱操作3、样品的加入和洗脱加样注意正确的加样操作：不要触及破坏凝胶面 贴壁加样使吸管管口沿管壁环绕 移动加入_，打开下端出口，进行洗脱 。待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收 集流出液。磷酸缓冲液二、从红细胞中提取和分离血红蛋白的流程（二）血红蛋白的纯化凝胶色谱操作3、样品的加入和洗脱样品的洗脱：色谱柱成功标志：红色区带均匀一致地移动 。在鉴定的方法中，使用最多的是_ 。纯化二、从红细胞中提取和分离血红蛋白的流程（三）纯度鉴定：判断_的蛋白质是否达到要求，需要进行 蛋白质纯度的鉴定。 SDS聚丙烯 酰胺凝胶电泳 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（动画演示） 1
