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1、浅谈PCR技术 -特异性DNA片段的PCR扩增生物05专升本田江平引 言 早期特异性DNA片段的扩增 体外DNA片段的扩增( 1983年PCR( ploymerase chain rection 聚合酶链式 反应)技术的应用) 现代PCR技术在基因扩增与分离、医疗 诊断、基因突变与检测、分子进化研 究及法医鉴定等诸多领域都有重要用 途。主要内容l PCR 的基本原理l PCR扩增的主要条件l靶DNA和模板lPCR引物lPCR原材料lPCR缓冲液lPCR循环的温度和时间lPCR扩增平台lPCR扩增DNA的方法l常用的DNA片段PCR扩增系统PCR基本原理vPCR反应是模仿细胞内发生的DNA复制过
2、 程进行的,在体外由酶催化合成特异性DNAv进行特异性DNA复制的一般过程为:1.反应系统加热至9095使底物双链 DNA变性成为两条单链;2.降温至3760使两种引物分别与模 板DNA链的3一侧的互补序列杂交(复性 );3.升温至7075,耐热性DNA聚合酶催化引物按3 5 方向沿伸,合成模板 DNA的互补链.重复以上过程,经过三次循环,就出现待 扩增的特异性DNA片段.(见下图)5G-G-TC-3 3-CC-A-T-590955-G-G-T-C-33-C-C-A-T-53745HO -A-G (引物 )5-G-G-T-C-33-C-C-A-T-5G-GOH(引物)70753-C-C-A-G
3、-5 5-G-G-T-C-35-G-G-T-C-3 3-C-C-A-G-5(扩增的特异性片段)909537457075909537457075(是扩增的特异性片段)(全部是扩增的特异性片段)(图一) PCR扩增特异性DNA片段过程(注: 每次PCR的效率并非100,扩增产 物中有部分PCR中间产物)PCR扩增的主要条件 v(一)耐热性DNA聚合酶1.Taq DNA 聚合酶(早期常用,原是喜温性细菌(Ther- mus aqaticus BM)内的一种耐热性DNA聚合酶,后将这种酶的 基因转入E.coli细胞中.现在市场上所销售的. Taq DNA 聚合酶 相对分子质量为:95103,具有强的5
4、 3DNA聚合酶活性 ,缺3 5和5 3外切酶活性. )2.Pwo DNA聚合酶(是从喜温性细菌(archaebacteri- um) Pyrococcus woesei中发现的,后将这种酶的基因转入到 E.coli细胞中,可进行大量生产.相对分子质量为:90103,具有 3 5外切酶活性,没有检测到5 3的活性 . ) 3.Tth DNA 聚合酶(此酶是从喜温性真细菌(Thermus Thermophilus HB8) 中提取的,具有强的5 3DNA聚合酶活 性,缺3 5聚合酶活性 .TthDNA聚合酶用于RT-PCR系统,可 以扩增至少1000bp长的cDNA片段. )4. C.therm
5、 DNA 聚合酶(这种酶是从Carboxydotherm- us hudregenoformans 中分离出的,是一种以Mg 离子为补助 因子的逆转录酶,最适温度60-70之间.在RT-PCR系统中催 化反转录反应,并具有3 5外切酶校对活性,合成cDNA的准确 度比用cDNA聚合酶二倍. )靶DNA和模板v作为PCR的靶DNA一般是一个待扩增 的特定双链DNA片段,应知道其两端 2030bp的核苷酸序列,供设计对引物 之用.靶DNA可以是环形DNA 分子的 一部分,也可以是线形DAN分子(或片 段)的一部分.作为PCR的模板是一条 单链DNA片段,其3端具有与引物杂交 的序列.PCR引物引物
6、是PCR过程中引导互补链DNA的一 种脱氧核苷酸寡聚体,其引物必须具有游离 的OH基因.为了有效地扩增特异性双链 DNA片段,设计和合成合适的引物是非常重 要的.设计引物应遵循以下几点: 1.根据DNA互补链聚合反应的原理,设计 的引物的核苷酸必须与模板链3端的一段 核苷酸序列互补,并且3端必须具有游离的-OH基因.S2.引物的长度与PCR过程的特异性高低 密切相关,引物长的,特异性高.为扩增特异 性高的DNA引物片段,一般设计的引物由 2030个核苷酸组成,4种核苷酸尽可能随 机分布,G与C含量应达4060，尽量避免 存在多聚嘌呤核苷酸、多聚嘧啶核苷酸或 异常核苷酸的序列。3.设计的引物中应
7、尽量避免回文结构序 列.尤其是在引物的3端不应有回文结构序 列。为了降低在PCR过程中形成引物二聚 体，设计引物时必须避免用于同一PCR过 程中的一对引物之间存在互补序列。v4.设计的引物中，最好含有进一步操作中 可利用的限制性核酸内切酶识别序列。若 靶细胞DNA一端或两端不含这样的序列， 则可以根据下一步操作，设计在引物5端 添加一些与模板DNA链核苷酸序列，使扩 增的DNA片段一端或两端引入核苷酸内切 酶识别序列。在这种情况下，设计的引物 要长一些。v5.如果扩增一个编码区域的DNA片段，设 计的引物应尽量避免5端的核苷酸与密码 子的第三位置（间并）的核苷酸的互补， 以次来防止3端的核苷酸
8、可能同模板错配以及由此引起的聚合反应受阻。 6.引物中的核苷酸序列与非靶DNA序列以及 靶DNA中引物互补序列以及以外的核苷酸 序列之间的同缘性不得超过70%，并且不 能有连续8个以上相同的核苷酸序列。PCR原材料vdATP、dGTP、dCTP和dTTP是PCR 的原 材料，通过PCR过程聚合成互补链DNA。 如果这些原材料中分别渗入Dig-UTP、Bi-otin-UTP、Flu-UTP等修饰过的核苷酸， 扩增出标记的DNA片段。因此，采用PCR 技术可以制备这些标记的DNA探针。PCR缓冲液vPCR缓冲液平时配置2倍的浓度，含140 mmol/L Tris-HCL(pH=8.8)、48 mm
9、oL/L MgCl2、40mmol/L (NH4)2SO4、30ug/ml BAS(无核酸酶)、16mmol/LDDT.PCR循环的温度和时间一般的PCR循环中，变性温度采用 9095 能否使双链DNA完全变性分开，这是 PCR扩增片段成败的重要原因。大多数情况下采 用94，持续20s。快速高温处理对保持DNA聚 合酶活性是必要的。复性温度取决于引物的长度和G、C含量， 对于长度为20个核苷酸、G、C含量为50%的典 型引物来说，55是比较合适的复性温度。如果 引物长度只有1215个核苷酸，则复性温度以 4045为益。由于反应系统中引物是过量的，引物 与模板杂交可以在瞬间时完成，所以复性 时间
10、不需要很长，常用20s。引物延伸在7075下进行。所需时间 随扩增DNA片段的长度而定，扩增1000pb 的DNA片段需1min,如果扩增片段在150bp以 下，甚至不需考虑延伸时间。PCR扩增平台v PCR 过程经过一定数次的循环后，待扩 增的DNA片段不在以指数关系继续累及， 而是进入以线性关系累积，而是进入以线 性关系累积或停止累积的平台期。对于含 有2.5单位Taq DNA聚合酶的100uL标准反 应系统而言，当扩增的DNA片段达到1ug 左右时，PCR扩增进入平台期。为保证扩 增的效率应尽量防止提前进入平台期。v导致提前进入平台期的原因：一方面是因 为反应开始时反应系统中作为模板的D
11、NA 拷贝数过量，当PCR经过一定次数循环后 ，使DNA聚合酶不足以催化以扩增的 DNA片段做为模板继续扩增；另一方面原 因是因为反应系统中加入的引物或dNTP的 量不足，或者是DNA聚合酶中途失活。vPCR过程中出现的平台期是不可避免的， 实际上为了获得足够量的扩增产物，不是 采用推迟进入平台期的办法，而是采取多 批扩增的方法。vPCR技术在实际应用中，根据各自的需要 摸索出了最适反应条件和操作方法，这里 仅介绍一种常规的方法：1.供PCR的微型试管中加入2ug靶DNA（ 约10uL）2.加入50uL2*PCR缓冲液，再加入每种 引物至6.6ug/mL，使引物终浓度为 1umol/L（100
12、ml反应系统中含100pmol） 。PCR扩增DNA的方法3.在98下变性7min，冷至室温，加入 57U Taq DNA聚合酶，终反应体积为 100ul，混匀，其上覆盖50100ul石蜡油， 防止蒸发。反应液离心10s，置于PCR仪中，70延 伸1min，92变性1min，37复性1min ，再在70延伸1min，92变性1min， 37复性1min，如此循环2530次，最后 延伸10min。4.扩增样品与-20保存待用。常用的DNA片段PCR扩增系统v 自从建立DNA片段PCR扩增系统以来, 无论在PCR技术的研究上,还是在PCR技 术的应用上,发展都非常迅速,建立了DNA 片段的多种PC
13、R扩增系统.现将其中几种常 用PCR扩增系统名称、扩增产物和主要特 点简单地列于下表（见下页）扩扩增系统统名称扩增产物主要特点一般PCR扩增系统0.110kb特异性DNA 片段见DNA扩增的一般性 质随机PCR扩增系统长短不一的DNA片段采用8bp随机引物长模板高准确PCR扩 增系统640kb特异性DNA采用TaqDNA聚合酶和 PwoDNA聚合酶C.Them聚合酶一步 RT-PCR扩增系统13kb cDNA片段以RNA为底物,采用多 种聚合酶Tth DNA聚合酶一步 RT-PCR扩增系统1Kb左右的cDNA片段以RNA为底物,同时采 用TthDNA聚合酶Titan一管RT-PCR扩 增系统可达6Kb cDNA片段以RNA为底物,采用多 种聚合酶富 G、C DNA片段 PCR扩增系统可达5Kb富GC DNA片 段采用TaqDNA聚合酶和 PwoDNA聚合酶谢谢观看!
