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1、第三章：微生物生态学的基本研究方法2016-11-61参考书l陈声明，林海萍，张立钦主编，微生物生态学导论， 高等教育出版社，2007l池振明主编，2005，现代微生物生态学，科学出版社l杨家新主编，2004，微生物生态学，化学工业出版社l宋福强主编，2008，化学工业出版社l张素琴著：2005， 科学出版社lMolecular Microbial Ecology, A. Mark Osborn 单菌落是否由一个 细菌繁殖而来；丝状微生物菌落究竟是由孢子 而来还是由菌丝而来难以区分2016-11-617经典的观察和培养方法能够在一定程度上告诉我们 样品中微生物的数量、可培养微生物的数量及类 型
2、。但这些结果不能告诉我们微生物在样品中能干什么 ？2016-11-618包括用于微生物生物量测定的氯仿熏蒸方法、底物 诱导呼吸法和光合微生物色素法等；用于测定土壤C矿化速率和微生物呼吸强度等方法 ；用于测定土壤中物质转化的生物活性和酶活性的分 析方法；测定微生物能量代谢的分析方法等2、生理生化方法2016-11-619代谢活力研究：放射性/稳定同位素标记记某种代谢物， 测定代谢活力 C14， C13， H3， N15酶活性测定ATP含量测定：ATP仅存在于活的细胞中，且在细胞中 的含量基本一致ATP检测仪2016-11-620代谢活力研究l叶绿素含量测定：估计藻 类和光合细菌的生物量和 代谢活
3、力l土壤呼吸速率测定：间接 估计土壤中的生物量，不 适于仅有厌氧呼吸或发酵 的微生物测定土壤呼吸测定仪2016-11-621代谢活力研究优点：能确定样品中微生物能做什么；缺点：无法说明样品究竟是哪些微生物 在起作用，样品存在哪些微生物种类和 微生物在自然样品中的分布情况2016-11-622lBiolog微平板法lPLFA图谱分析2016-11-623Biolog 微生物自动分析系统是美国Biolog 公司从 1989 年开始推出的一套微生物鉴定系统，最早进入 商品化应用的是G-好氧细菌鉴定数据库(GN) ,其后陆 续推出G+好氧细菌( GP) 、酵母菌( YT) 、厌氧细菌 (AN) 和丝状
4、真菌(FF) 鉴定数据库。Biolog 系统6101 版数据库共包括1973 种微生物， 其中细菌234 个属，1 226 个种，与其他鉴定系统相比，其微生物种类的数据量较大，适合于环境、食 品、工业、临床和动植物病原菌的鉴定分析。BIOLOG微平板法2016-11-624Biolog 自动微生物分析系统主要根据细菌对糖、 醇、酸、酯、胺和大分子聚合物等95 种碳源的利用情况进行鉴定。细菌利用碳源进行呼吸时,会将四唑类氧化还原染色 剂( TV) 从无色还原成紫色，从而在鉴定微平板上形 成该菌株特征性的反应模式或“指纹图谱”。通过纤维光学读取设备读数仪来读取颜色变化, 由计算机通过概率最大模拟法
5、将该反应模式或“指纹 图谱”与数据库相比较，将目标菌株与数据库相关菌 株的特征数据进行比对，获得最大限度的匹配,可以 在瞬间得到鉴定结果，确定所分析的菌株的属名或种 名。 2016-11-625BIOLOG ECO微平板含3组相同的碳源，根据平均颜色变化情况，计算 微生物群落的多样性指数、代谢特征的变化等。2016-11-6262016-11-627四氯唑染料96孔微孔板2016-11-628培养时间 (h)浅层含水层沉积物中微生物群落培养过程中AWCD的变化2016-11-629赵锐等，20102016-11-630赵锐等，20102016-11-631赵锐等，20102016-11-632
6、磷脂类化合物只存在于细胞膜中，不同微生物其磷 脂脂肪酸组成和含量都不相同。一旦生物细胞死亡，其中的磷脂化合物马上降解。 因此该方法十分适合于微生物群落的动态监测。PLFA图谱分析2016-11-633细胞膜磷脂双分子层2016-11-634毛细管柱 2016-11-635Typical GC-FID signal of extracted PLFAs under (a) landfill gas ddition (W+LG) and (b) the control treatment (W, grey colour in the enlargement) in 20 cm soil depth
7、. (1) i14:0, (2) 14:0, (3) i15:0, (4) a15:0, (5) 15:0, (6) i16:0, (7) 16:1o8c, (8) 16:1o7c, (9) 16:1o6c, (10) 16:1o5c, (11) 16:0, (12) 10Me16:0, (13) i17:0, (14) a17:0, (15) 17:1o8c, (16) cy17:0, (17) 17:0, (18) 10Me17:0, (19) 18:2o6,9, (20) 18:1o9c, (21) 18:1o8c, (22) 18:1o7c, (23) 18:0, (24) cy19:
8、0, (IS) internal standard 19:0.Watzinger et al.,2008,Soil Biology 鉴于DNA中要求N 的含量相对较低，SIP 技术比较适合研究与碳素转化有关的活性微生物群落。4、稳定同位素?方法2016-11-643什么是微生物生态学？微生物生态学的研究方法有哪些？每种方法的优缺点是什么？举例说明上节内容回顾 2015.12.12016-11-6442016-11-645基本知识氨氧化 NH3+NO2- NO3- 硝化作用amoA（功能基因） 氨氧化细菌（AOB）, 氨氧化古菌（AOA）抑制剂的使用： （1） dicyandiamide (DC
9、D,双氰胺)， allylthiourea（烯丙基硫脲 ）， Nitrapyrin（三氯甲基吡啶）【对AOA和AOB均有抑制性，但 对AOB的抑制作用更强】； （2）karrnamycin；sulfathiazole（磺胺噻唑）抗生素类，AOB； （3）NO-scavenger carboxy-PTIO 【强烈抑制AOA，对AOB影响 不大】二者的功能基因的序列不同，可以用不同的引物分别扩增 PNR：potential nitrification rate 大多数AOA属于自养型，少数混养型2016-11-6462016-11-647文章剖析主要观点： 强酸性土壤中氨氧化古菌比氨氧化细菌对氨氧
10、化所起的作用 更重要涉及到的微生物生态学方法： 分子生物学（PCR, DGGE） 稳定同位素标记（SIP） 生理生化方法2016-11-648主 要 论 据Significantly positive correlations between nitrate concentration and amoA gene abundance of AOA, but not of AOB.13CO2-DNA-stable isotope probing results showed significant assimilation of 13C-labeled carbon source into th
11、e amoA gene of AOA, but not of AOB.Addition of the nitrification inhibitor dicyandiamide (DCD,双氰胺) completely inhibited the nitrification activity and CO2 fixation by AOA, accompanied by decreasing thaumarchaeal amoA gene abundance.Bacterial amoA gene abundance decreased in all microcosms irrespecti
12、ve of DCD addition, and mostly showed no correlation with nitrate concentrations.2016-11-649DCD的加入能强 烈抑制土壤中氨氧 化作用的进行. 无抑制剂添加抑制剂2016-11-650DCD的加入使 得AOA amoA 基因丰度减少AOA amoA拷贝数无DCD添加DCD2016-11-651DCD的加入对AOB amoA基因的丰度 变化影响不大AOB amoA拷贝数无DCD添加DCD2016-11-652AOA amoA拷贝数NO3-浓度2016-11-653AOA amoA基因丰度与NO2-浓度正相
13、关，而AOB amoA基因与NO3-负相关2016-11-654稳定同位素标记实验（AOA对氨氧化起着重要作用） 无DCD，NO3-升高，NH4+稳定，AOA amoA丰度相对不变，而AOB amoA丰度下降。 有DCD， NO3-不变，NH4+上升，AOA和AOB amoA丰度下降。NH4+浓度2016-11-65512C标记12C标记13C标记13C标记13C标记 +DCD2016-11-656Eight arrows marked the bands in heavy fraction around a buoyant density of 1.73 gml-1 excised for sequencing active 13CO2-labeled AOA belonged to groups 1.1a-associated and 1.1b.2016-11-657洞穴微生物生态学氨氧化微生物生态学湿地微生物生态学植物共生微生物生态学（要求每人下载1篇英文文献，并就该文献的主要论 点、论据、方法和结论等进行解说和释义），交纸质 版课后作业2016-11-658
