基因工程技术 (Genetic engineering)l分：目的基因的获取、载体的选择l切：限制性内切酶的应用l接：用连接酶将目的基因和载体连接重组体l转：将重组体导入到受体细胞l筛：采用适当的方法筛选出含有目的基因的阳性克隆l表：目的基因在受体细胞表达，获取表达产物基因工程的基本程序： 分、切、接、转、筛、表G CCTAG G CCTAGG CCTAG G CCTAG分分切切接接转转筛筛 表基因工程实验特点及要求l1. 微量操作 l 2. 连续性操作 l 3. 低温操作 l 4. 防止污染（试剂污染、细菌污染）l 5. 实验物品切忌乱扔乱丢 l 6. 认真写好实验纪录l第一次实验: 质粒DNA大量制备、浓度及纯度分析l第二次实验： RT-PCRl第三次实验：DNA限制性内切酶消化、电泳、片段回收、重组连接l第四次实验：重组质粒的转化、Southern杂交演示l第五次实验：重组质粒的鉴定（质粒DNA小量快速制备、酶切、电泳）、考试基因工程实验安排实验一 质粒DNA大量制备、浓度及纯度分析l目的：获得高浓度、高纯度的质粒DNA为 酶切和基因转染作准备质粒 （plasmid）：能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息, 会赋予宿主 细胞一些遗传性状。
基本步骤：l细菌的生长和质粒的扩增: 将表达质粒DNA的活细菌进行大量培养l细菌的采集和裂解,抽提质粒DNA：碱变性法提质粒 ；l质粒DNA的提纯:除蛋白质、RNA和与质粒DNA分子量相近的断裂DNA 碱变性抽提质粒DNA原理：l利用质粒DNA与染色体DNA分子大小不同，变性和 复性的差异l在pH=12.6的NaOH-SDS环境下，质粒DNA与染色体DNA的氢键均破坏，但是染色体DNA断裂成线状， 而质粒DNA仍为闭环，且相互缠绕没有分开当 pH调整到7.0，质粒DNA复性存在溶液中，而染色 体DNA不能复性与变性的蛋白质、SDS相互缠绕形 成沉淀，经离心被分离质粒DNA的纯化：l蛋白质的清除：蛋白质的变性剂——酚和氯仿.lRNA的清除：RNA酶消化；LiCl沉淀;层析l与质粒分子量相近的线状断裂的DNA分子的清除：等体积1.6mol/L NaCl , 13%PEG; CsCl梯度超速离心等Sepharose 2B柱层析法（琼脂糖凝胶柱）l利用分子筛效应，分子量大的分子不能 进入凝胶颗粒网孔，顺着颗粒间隙先流 出，分子量小的分子进入凝胶颗粒孔经内，流程长，后流出来质粒DNA分子 量大于RNA，故先洗脱下来。
LiCl沉淀法：Li+可与RNA结合，形成锂盐沉淀，而DNA不与锂结合，故经离心可将二者分离聚乙二醇沉淀法：只沉淀环状DNA操作步骤:收集细菌溶菌酶GET破壁SDS-NaOHpH=12.6碱变性KAcpH=4.8质粒DNA完全复性染色体DNA不能复性离心上清: 质粒,小分子RNA,少量蛋白质沉淀: 染色体DNA, 大分子RNA ,SDS-蛋白质复合物取上清, 加等体积异丙醇 沉淀DNA(缩小体积)离心沉淀溶于TE等体积LiCl沉淀RNA离心加等体积酚 氯仿异戊醇去杂蛋白离心,取上 层水相酚氯仿异戊醇重复一次离心,取上 层水相2倍体积无水乙醇0.1体积NaAc沉淀DNA离心70%乙醇 清洗沉淀晾干TE(50ul)溶 解沉淀取5ul电 泳鉴定取上清, 加等体积 异丙醇沉淀DNA( 缩小体积)离心沉淀溶于 500ul TE， RNA酶消化 30minDNA片段的琼脂糖凝胶电泳分离l原理 以琼脂糖为电泳支持物，DNA因分子大小、形状、构象不同 ，在相同的电泳条件下，因迁移率不同而被分离DNA可与荧光染 料——溴化乙锭（EB）结合，在紫外灯照射下呈桔红色荧光条带 DNA可与荧光染料——Goldview结合，在紫外灯照射下呈绿色荧光 条带。
l琼脂糖凝胶电泳的优点：操作简单，电泳速度快，样品不需事先处 理；琼脂糖凝胶结构均匀，含水量大（约占98-99％），近似自由 电泳，样品扩散较自由电泳小，对样品吸附小，电泳图谱清晰，分 辨率高，重复性好；凝胶透明无紫外吸收，电泳过程和结果可直接 用字外监测及定量测定；区带易染色，样品易洗脱，便于定量测定 ，制成干膜可长期保存DNA的琼脂糖凝胶电泳影响因素：l1. 核酸分子大小：迁移率与分子量的对数成反 比，但当>20kb时，迁移率不再依赖于分子大小；l2. 核酸构型:分子量相同的情况下，共价闭环 DNA>直线DNA>开环环状DNA l3.与凝胶浓度关系:一定大小的DNA在不同凝胶浓 度中迁移率不同；l4.其它影响因素：缓冲液的成分、离子强度及电 压（ 2.01.8, RNA污染<1.8, 蛋白质污染浓度计算：A260×40/50×250÷1000(μg/μl)结果分析：线状DNA超螺旋DNA。