法医学--法医DNA分型

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1、第18章 法医DNA分型法医物证学基本概念： 对涉及法律问题的生物性检材进行检验，解决 个人识别和亲权鉴定问题的法医学分支学科基本任务：个人识别-揭示个体身份亲权鉴定-判定备检者之间是否存在生物学亲缘关系一、基本概念：1.基因(gene)：染色体上一段特定的DNA片段。2.基因座/位点(locus)：基因在染色体上的特定位置。3.等位基因(allele): 一个基因座上的基因存有DNA一级结构差异。4.基因型(genetype)：基因座上成对等位基因的组合。5.表型(phenotype)：通过一定手段观察到的个体性状。法医常用遗传标记遗传标记的检测方法： v血清学方法 检验红细胞血型、白细胞血

2、型、红细胞酶型、血清型 vDNA检验技术 RFLP技术、 PCR技术二、DNA水平的遗传标记1 1、 DNADNA的分子结构的分子结构 DNA的二级结构-双螺旋结构 1953年， Watson 和Crick 提出了DNA双螺旋结构模式。变性：双链间氢键的断裂，形成两条多核苷酸单链的过程引起DNA变性的因素主要有高温、强酸强碱、 有机溶剂等。DNA变性后，性质发生改变。核酸分子杂交(hybridization)根据核酸分子变性及复性的性质，通过碱基配对使不同来源的两条多核苷酸链相互结合。在某些因素的影响下，例如紫外线 、DNA酶等，可以 使DNA分子中的磷酸二酯键断裂，形 成多个分子量更小 的D

3、NA片段，这个 过程叫作DNA降解。2、DNA多态性等位基因（或DNA片段）存在两种以 上形式，且每种等位基因频率0.01，本质为碱基构成发生改变（点突变、 缺失、插入或置换），分为长度多态 性和序列多态性。DNA长度多态性由同一基因座上各等位基因之间DNA片段长度差异构成的多态性。DNA序列多态性基因组DNA核苷酸序列在个体排列上存在巨大差异，这种差异形成DNA片段序列多态性。单核苷酸多态性（SNP）人类基因组范围内，如果任何单碱基突变使特定核苷酸位置上出现两种碱基，其中最少的一种在群体中的频率不 少于1%小卫星DNA：一类由10-100bp长度重复单位形成的卫星DNA，序列总长度100-2

4、0kb，又称可变数目串联重复序列（ VNTR）形成机制主要是不等交换微卫星DNA：一类由2-6bp长度重复单位形成的卫星DNA，串联重复10-60次 ，总长度多小于300bp，又称短串联重复序列（STR），形成机制主要为复制滑脱线粒体基因组（mtDNA）v母系遗传v单倍型遗传v多拷贝v突变率高v高度多态性v异质性3、DNA多态性检测技术限制片段长度多态性（限制片段长度多态性（RFLPRFLP）限制性内切酶：识别双链DNA分子中特定核苷 酸序列，并在特定部位以内切方式水解DNA链 的核酸水解酶。由于DNA限制酶识别的序列核苷酸结构发生改变，导致酶切位点的产生、消失或移位，酶切所产生的限制性片段数

5、目和长度改变所呈现出的DNA多态性。RFLP试验流程图DNA纹印：RFLP分析杂交时使用单基因座探针，高度严格杂交条件下，仅与一个小卫星基因座等位片段杂交，形 成单基因座RFLP图谱。DNA指纹：RFLP分析杂交时，使用多基因座探针，不严格杂交条件下，与多个小卫星基因座等位片段杂交，形成多基因 座RFLP图谱。 英国科学家 Jeffreys采用PCR扩增VNTR或STR基因座等位基因进行DNA长度多态性分析的方法。扩增片段长度多态性分析（amp-FLP） ：聚合酶链式反应(PCR)原理：模拟天然DNA复制的体外DNA扩增方法。以基因组DNA为模板,以一对寡核苷酸为引物,dNTP为原料, 在耐热

6、多聚酶存在下，反复经过变性、退火、引物延伸三个步骤,使靶DNA片段得到复制。变性(denaturation)：加热至95，使模板DNA双链的氢键断裂而解离成两条单链。退火(annealing)：降温至55左右，引物寡核苷酸与模板DNA互补序列复性，形成模板-引物杂交双链。两引物的3端彼此相对。 延伸(extension)：升温至72，在耐热DNA聚合酶的作用下，以碱基配对原则，dNTP逐个连接在引物的3端。引物由5端3端方向被延伸、合成与靶DNA序列互补的DNA新链。 经过变性退火延伸的一次循环，靶DNA片段被复制一次。新合成的DNA链又可成为下一循环的模板。经过n次循环后，产生在两引物间的靶

7、DNA短片段数量为2n-2n条。30次循环后，理论上DNA拷贝数可达105-107。 PCR产物经电泳分离，显带杂合子为两条长度不等的片段，纯合子为一条片段；根据片段长度判定等位基因和基因型1.高灵敏度，适于陈旧、降解、腐败检材；2.特异性高；3.可复合扩增；4.种属特异性；5.实验周期短，设备条件和操作相对简单。PCR技术用于法医学的特点短串联重复序列（STR）：广泛存在于人类基因组中的一类具有长度多态性的DNA序列，基序为2-6bp，串联重复10-60次 ，总长度多小于300bp，形成机制主要为复制滑脱。STR基因座命名原则：v编码区，依据所在基因名称命名v非编码区，依据首次进入公共数据库

8、的序号命名STR基因等位基因命名原则：v等位基因根据所含重复单位数目命名等位基因。v含有不完整基序的等位基因命名：在完整等位基 因数后面加一小数点，小数点后面为不完整序列 含有的碱基数。Ladder5-12Ladder5-12Ladder5-121 2 34 5 6基因型1: (8,8); 2: (8,10) 3: (8,8); 4: (7,9)5: (8,8); 6: (8,9)CSF1POD5S818D21S11TH01TPOXD13S317D7S820D16S539D18S51D8S1179D3S1358FGAVWAAMELAMEL性别基因美国联合DNA检索系统 （ CODIS）的13个

9、 STRs应用于法医的STR应满足以下条件v PCR扩增产物长度在300bp以下v宜选择四核苷酸STR基因座v选多个STR基因座应不在同一条染色体上v每个STR基因座等位基因数8-10个左右v基因频率分布均匀，没有高或低频基因出现 v杂合度高，最好大于0.80；v低突变率0.2%。多基因座复合扩增（multiplex amplification ）v在一个PCR体系中同时扩增多个基因座v如果同时检测816个STR基因座，鉴别能力能够达到DNA指纹的水平。 v优点：高效、经济、快速。 v目前常用的复合扩增方法有两种： 银染系统、多色荧光自动检测系统银染系统多基因座复合扩增产物电泳分离后，PAG凝

10、胶直接用银染显带。体系中多个基因座的基因长度范围必须互不重叠。操作简单，经济实用。因为片段长度范围选择受限制，能够同时扩增的基因座个数有限。 荧光标记的自动检测系统 常采用复合扩增即在同一反应管中同时扩增多个STR基因座，自动化的激光荧光检测系统进行PCR产物分型原理：荧光染料标记在一条PCR引物的5端，在PCR扩增时，PCR产物带上荧光标记。电泳时，标记有荧光染料的DNA片段由激光诱发荧光而被检测。D8S1179D21S11D7S820CSF1POD3S1358TH01D13S317D16S539D2S1338D19S433D18S51TPOXVWAAMELD5S818FGAGS500 LI

11、Z size standard6FAM (blue)VIC (green)NED (yellow)PET (red)LIZ (orange)AmpFlSTR Identifiler法医遗传学应用STR的特点在于：v高灵敏度v扩增的片段短v使用生物检材类型广泛v分型简单，可标准化v染色体定位明确PCR-STR：国内外法医个人识别和亲子鉴定的主流技 术长度多态性分型局限性 案发现场只发现有头发或长期暴露于外界环境的骨骼，这些检材中核 DNA含量很少或降解，无法进行长度 多态性（如STR）分型。 vPCR-ASO技术HLA-DQAl 基因座vPCR-RFLP技术ABO基因、 mtDNAvDNA序列分

12、析mtDNA分型法医学上常用的序列多态性分析技术PCR-RFLP技术 利用两个片段之间的序列差异，而且这种差异刚好构成一个限制性核酸内切酶识别位点，或使原有的限制酶识别位点丢失或识别位点移动了位置，选择合适的限制酶切割 PCR产物，从长度不一的DNA酶切片段，可以判断等位基因及基因型。DNA序列分析（一）Sanger双脱氧末端终止法（二）循环测序 （cycle sequencing）（三）荧光标记循环测序全自动分析排除不排除/ 认定个人识别的 系统效能遗传标记同一人？未知样本Q已知样本K个人识别能力(discrimination power,DP) ：指从群体中随机抽取两名个体，其遗传标记表型

13、不相同的概率。v评价该遗传标记系统识别无关个体效能大小的指标，即反应遗传标记区分不同人的能力；v遗传标记的多态性越高，个人识别能力越强，遗传标记的效能就越高。遗传标记个人识别的系统效能计算公式式中 n 为一个遗传标记的表型数目，Pi 为群体中第 i 个表型的频率。Pi 2 为人群中随机抽取的两个样本，纯粹由于机会而一致的概率(Q)。累积个人识别能力（TDP）遗传标记数目越多，个人识别能力愈强。提高系统的个人识别能力可以通过增加检测的遗传标记数 目来实现。若检测k个遗传标记，其累积个人识别能力计算公式为：一名随机个体碰巧与作为证据的检材表型匹配的可能性，又称为随机匹配概率或随机个体碰巧匹配概率。

14、是对一个特定的（组合）遗传标记表型可能出现在人群中的概率，也可以说是从一个人群中随机抽取一个样本，会出现特定表型的理论概率。匹配概率（ probability of match, Pm）Pm的意义v当两份检材的遗传标记表型匹配时，如果现场检 材不是嫌疑人留下的，而是一个从群体中随机抽 出的个体留下的，遇到这种个体的可能性有多大 。v这个概率越小，遇到这种个体的可能性就越小， 说明现场检材与嫌疑人样本的表型匹配非常不像 是一个随机事件，而是支持这两个样本来自同一 个人的假设，也就是支持现场检材是嫌疑人留下 的假设。似然率（likelihood, LR） 似然率基于两个表型组合来自同一个体的假设 衡量证据的强度。v 例如，现场血痕DNA和嫌疑人血液DNA表型组合均为X ，可以考虑两种假设：现场血痕是嫌疑人所留（原告 假设） ；现场血痕是一个与案件无关的随机个体所留（被告假设）。v 似然率是假设条件下现场血痕与嫌疑人的表型 组合都 是 X 的概率 Pr（EHp）=1；与假设条件下现场血 痕与嫌疑人的表型组合都是 X 的概率（Pr（EHd）= P（X） 之 比，即 LR=1/P（X）谢 谢！