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1、1血栓与止血检测进展王鸿利 上海交通大学医学院附属瑞金医院， 上海血液学研究所，2000252近年，随着基础理论和实验技术的 发展，血栓和止血检验及其临床应用 也有了很大的进展，本文就此作一简 述。3（一）血小板微颗粒检测血小板被激活后，以出芽方式形成囊泡或以 伪足断裂方式形成直径为0.11.0m的血小板颗 粒（Platelet Microparticle,PMP)。PMP的体积较正 常血小板小，但有完整的血小板膜结构和功能。 PMP膜上可表达多种血小板膜糖蛋白（GP） b/a（ GP b/a）、 GPb/-、血小板 活化因子（PAF）、-样前体淀粉蛋白、Ca2+依 赖性蛋白酶Calpainy
2、i以及有促凝作用的磷脂等。 因此检测血循环中的PMP可较完整地反映血小板参 与血栓形成和血液凝固的功能。45检测方法流式细胞术。主要试剂为 CD61 parcp:多甲藻素-叶绿素蛋白标记抗血 小板GPa的单克隆抗体参考值6617个/104血小板（山东大 学齐鲁医院报道）。6临床意义PMP主要用于动脉血栓性疾病的 检测，它是动脉血栓形成的敏感和特异的分子标 志物。1.急性冠脉综合征（ACS）：有证据显示， PMP参与动脉粥样硬化和血管再梗塞的病理过程 。Cawaz等对急性心肌梗死（AMI）施行PTCA患 者进行系列血小板功能研究，发现PTCA术后患 者的血小板数因消耗增加而减少，PMP因大量形
3、成而增多，后者又参与冠脉血栓的形成。 Katopodis等对行冠脉血栓形成术的ACS患者进行 观察，他们将血小板激活状态作为试验组（近期 发生AMI、不稳定性心绞痛者），结果发现，试 验组患者PMP水平较正常对照组明显增高。72.脑血栓形成：对大血管血栓、小血管 血栓、多发性脑梗死和阿尔茨海默病患者 进行PMP检测。结果发现，阿尔茨海默病 患者的PMP水平与正常对照组无统计学差 异，而其他疾病组患者的PMP水平均显著 高于正常对照组，且治疗后有明显的降低 ，而且小血管血栓组患者的PMP水平高于 大血管血栓组患者。表明PMP水平的增高 ，主要反映小动脉的血栓形成和血栓阻塞 。8（二）血小板-白细
4、胞聚集体检测血小板被激活后，血小板释放P-选择素 （P-selectin或GMP-140）。 P-选择素与白 细胞和（或）单核细胞膜上的P-选择素配 体糖蛋白-1（PSLG-1）结合形成血小板-白 细胞聚集物（Platelet-Leucocyte Aggre -gate,PLA)和（或）血小板-单核细胞聚集物 （ Platelet-Monocyte Aggregate）。该聚 集体是反映动脉血栓形成的特异性标志物 之一。9检测方法流式细胞术。主要试剂为 FTTC标记的鼠抗人GPIb（CD42b）单克隆 抗体，藻红蛋白标记的抗人白细胞CD45单 克隆抗体，FTTC标记的鼠抗人P-selectin
5、 （CD62b）单克隆抗体。参考值瑞典学者报道血小板-白细胞 聚集物为15.38.5（PLA/L）。10临床意义动物实验和临床研究表明 ，PLA是更敏感和更特异的血栓标志物。一 组93例胸痛患者，其中9例为AMI患者，其 血小板-单核细胞聚集物为34.210.3，84 例非AMI胸痛患者的血小板-单核细胞聚集 体为19.31.4，二组差异显著（0.05 ）； AMI胸痛组和非AMI胸痛组患者的血小 板-单核细胞聚集物水平均较10例正常对照 组的血小板-单核细胞聚集物水平为高（ 0.001）。11（三）血管性血友病因子裂解蛋白酶活性检测生理情况下，由血管内皮细胞合成的血管 性血友病因子（von
6、Willebrand Factor, vWF）主要受vWF裂解蛋白酶（ vWF C- leaving Proteinase, vWF -CP）的调节。 vWF CP作用于 vWF分子量为250000多聚 体的Try（842）-Met（843）之间的肽键， 将它们水解成分子量为176000和140000的 两个小分子肽段。此时vWF不能过度地参与 血小板的粘附和聚集，因此vWF CP是限制血栓形成的标志物之一。121314检测方法ELISA。以型胶原包被酶标板 ，2.5BSA封闭，分别加入未透析的标本和经 Slide-A-Lyzer透析过的标本，一抗为兔抗人vWF 多抗，二抗为辣根过氧化物酶标记
7、的羊抗兔IgG， 加入底物OPD490nm显色。结果以透析前后的 OPD490比值作为该份标本的残余胶原结合活性 （ vWF:CBA或R- CBA ）表示， R- CBA 越高， vWF-CP活性越低。参考值83例正常人血浆（n 30） vWF:CBA 范围为2.140.5（21.99.2） ；血清（n 53） vWF:CBA范围为2.4 52.0（20.510.8）（苏州大学附一院）。15临床意义1.血栓性血小板减少性紫癜（TTP）：由 于患者的vWF-CP基因缺陷或患者血浆中存 在抗vWF-CP自身抗体，使vWF-CP血浆水 平显著降低，不能正常裂解超大分子量的 vWF多聚体（UL- vW
8、F ）。体内聚集的UL- vWF 易于血小板结合，促使血小板粘附和 聚集，引起TTP病理过程的发生和发展。一 组5例TTP患者检测vWF:CBA结果为48.1 96.5（78.220.2），较正常对照组 明显增高，反映患者vWF-CP明显降低。162.血管性血友病（vWD）：据报道，21 例vWF患者血浆vWF:CBA水平明显降于30 例正常人、15例血友病患者及30例其他出 血性疾病患者（0.001）。在vWF中， 型患者的vWF:Ag/ vWF:CBA比值1.0； 型患者的vWF:Ag/ vWF:CBA比值2.0； 型患者的vWF:Ag/ vWF:CBA都极低，其 vWF:Ag/ vWF:
9、CBA比值具有可变性。173.恶性肿瘤：恶性肿瘤患者的vWF-CP活 性水平显著低于正常人，伴有远处转移患 者的vWF-CP活性水平更低，接受手术治疗 后患者的vWF-CP可升高，导致血浆大分子 多聚体增多，促使vWF参与血小板粘附和 聚集，加剧恶性肿瘤患者的高凝集状态和 血栓形成，反映vWF是参与恶性肿瘤血栓 形成机制之一。18(四)单克隆抗体特异性俘获血小板抗原检测 （monoclonal antibody specific immobili- zation of platelet antigen,MAIPA）将待测抗体、单抗和血小板共同温育， 得到血小板膜GP、待测标本和单抗三分子 复合
10、物，然后加入酶联抗体并以微粒色被 抗体固化于微孔中显色，显色深浅与待测 抗体水平呈正比。参考值抗GP b/a阳性，A值 0.133；抗GPb阳性， A值0.2091920临床意义检测血小板相关抗体，其 敏感度和特异度高于双抗体夹心ELISA法。 用于检测ITP和同种免疫血小板减少症。21两种方法对ITP诊断的比较ELISA法 MAIPA法PAIgGPAIgAPAIgMGPb/aGPb阳性率（）8127225413敏感性（）8866607566特异性（）5075768394诊断效率（）722722731322(五)凝血酶激活的纤溶抑制物（TAFI）检测凝血酶-凝血酶调节蛋白复合物（T-TM） 将
11、由肝脏合成的、分子量为55KD的凝血酶 激活的纤溶抑制物（Thrombin Activatable Fibrinolysis Inhibitor,TAFI）的Arg（92）- Ala（93）之间的肽键水解后，脱去一个活 化肽， TAFI变成活化型的TAFI a。 TAFI具 有抑制纤溶酶原转化为纤溶酶的生物活性 ，但是TAFI也受蛋白C抑制物（PCI）的抑 制。2324检测方法 采用 ELISA测定TAFI： Ag。以鼠抗人TAFI单克隆抗体包被酶标板 ，加入标准品或样品后，再加入辣根过氧 化物酶标记的抗人TAFI抗体，充分作用后 加入邻苯二胺使之显色，显色深浅与样本 TAFI的含量成正比。
12、TAFI:A采用发色底物 法测定。参考值 TAFI:Ag （n 34）为77 28 （21133）； TAFI:A （n 34 ）为24 5g/L（1434g/L）（上海瑞金 医院）25临床意义1.深静脉血栓（DVT）：Tiburg等对脑74例 初发DVT患者的TAFI:Ag 进行检测，发现其水平 增高。口服避孕药的正常生育期妇女，若TAFI： Ag水平超过90，其水平的危险性水平2倍，此 时患者的纤溶活性减低。2.动脉血栓（冠心病）：瑞金医院对19例冠 心病患者检测了TAFI:Ag和TAFI:A，发现冠心病 患者的TAFI:Ag和TAFI:A的水平均高于正常对照 组（0.001），与Silv
13、eira报道11例冠心病的 检测结果一致，表明患者的纤溶活性明显降低。 此外， TAFI水平增高也见于不稳定性心绞痛。263.微血栓（DIC）：瑞金医院对15例 DIC患者检测了TAFI:Ag和TAFI:A，发现患 者的水平明显低于正常对照组（0.001 ），表明患者纤溶活性明显升高。4.其他：TAFI水平升高还见于感染、因 子V Leiden突变； TAFI水平减低还见于某 些凝血因子缺乏（血友病、F缺乏症）、 急性早幼粒细胞白血病（ TAFI:A减低66 ，但TAFI:Ag正常）。27（六）可溶性血管内皮细胞蛋白C受体检测可溶性血管内皮细胞蛋白C受体（Soluble Endothelial
14、 Protein C Receptoe,sEPCR）是由血 管内皮细胞产生，部分与内皮细胞连接称膜连 EPCR，一部分流离于血浆称sEPCR。克隆的膜 连EPCR cDNA全长1.3kb,是一种由221个氨基酸 组成跨膜糖蛋白。膜连EPCR 通过促进T-TM复合 物与蛋白C（PC）的结合，进而放大PC的活性； 此外， EPCR还对体内急性炎症反应河DIC的发 生具有保护作用。然而，血浆中sEPCR与膜连的 EPCR具有相反的作用。 sEPCR也可与PC和活 化蛋白C（APC）结合。抑制PC的活化和抑制 APC的抗凝活性，减轻膜连EPCR的增强PC活化 和APC的抗凝作用，所以血浆sEPCR水平
15、的增高 市反映血管损伤和抗APC抗凝作用的特异性标志 物。28检测方法采用 ELISA。以单克隆-抗 包被酶标板，分别加入血浆标本和不同稀 释度的sEPCR标准品后，以生物素标记的 单克隆二抗作为检测抗体，加入底物后显 色，绘制标准曲线。参考值血浆sEPCR为 115.220.7g/L29临床意义安徽省立医院报道的结果见表1组别nsEPCR（g/L）值正常对照值20115.2020.70冠心病组30134.2069.60心绞痛17148.9087.90心肌梗死 8117.6033.80糖尿病组56177.0081.400.001败血症组30172.6043.700.001 SLE合并血栓组 1
16、4144.7033.900.005 SLE血栓组49165.8045.300.00130（七）蛋白C Global试验凝血酶（T）与血管内皮细胞的凝血酶 调节蛋白（TM）形成复合物（T-TM），后 者使PC转化为APC。 APC在蛋白S（PS） 的辅助下，灭活因子Va和因子a，还抑制 纤溶酶原激活抑制物-1（PAI-1），使纤溶 活性增强。然而，Agkistrodon contorix蛇 毒可以取代T-TM复合物直接激活PC，使 PC转化为APC， APC也受PAI的抑制。31检测方法在待测血浆中加入蛇毒温 育，蛇毒可直接激活PC，使PC转化为AP-C。随后在检测系统中加入APTT试剂以检 测依赖PC活性的血浆凝固时间（Protein C Activ-I
