黄曲霉毒素及其分析方法

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1、黄曲霉毒素及其分析方法中国疾病预防控制中心营养与食品安全所真菌毒素 真菌毒素（mycotoxins）是真菌的次级 代谢产物，是农产品的主要污染物之一 ，目前已知的真菌毒素有200多种，其 中研究较为深入的有十几种。根据真菌 毒素作用的靶器官或真菌毒素引起的病 理改变，可将真菌毒素分为肝脏毒、肾 脏毒、神经毒、震颤毒等。 真菌毒素对农业及人类健康的危害程度和 对社会经济发展影响的重要性 对世界上30多个国家和地区进行了调查，结果表明， 危害程度排在第一位的是黄曲霉毒素（aflatoxins, AF，包括AFB1、AFB2、AFG1、AFG2和AFM1） ，其次为赭曲霉毒素A(ochratoxin

2、 A，OTA)、单端 孢霉烯族化合物(trichothecenes)、玉米赤霉烯酮 (zearalenone，ZEN)、桔青霉素(citrinin)、杂色曲 霉素(sterigmatocystins，ST)、展青霉素(patulin， Pat)、圆弧偶氮酸 (cyclopiazonic acid, CPA)等。进 行这项调查时伏马菌素(fumonisin，FM)还未被发现 。 污染对象及其后果 真菌毒素污染最严重的农产品是玉米、 花生和小麦，人类和动物摄入被真菌毒 素污染的农产品后可导致急慢性中毒， 称为真菌毒素中毒症。 后果 历史上由真菌毒素导致的中毒事件层出 不穷，即使是今天，特别是亚热带

3、发展 中国家，真菌毒素仍是某些疾病甚至死 亡的主要原因。 真菌毒素对我国农产品的影响 我国是一个农业大国，小麦、玉米、大 米及花生等是居民的主要食品原料，各 类粮油食品均不同程度地被真菌及其毒 素污染，几乎所有的真菌毒素在我国农 产品中均可检出。我国每年约有2%的（ 二千五百万公斤）的粮食因受真菌毒素 污染而不能食用。真菌毒素对我国农产品的影响 真菌毒素污染粮油食品还严重影响我国的对外出口贸 易。花生是我国大宗出口农产品之一，年创汇约4亿 美元，而欧盟是主要出口市场。但自2000年，欧盟实 施国际上最严格的黄曲霉毒素限量标准和检验要求（ AFB1为2g/kg，总黄曲霉毒素为4g/kg）以来，欧

4、 盟以我少量花生检出黄曲霉毒素超标时有发生为由， 不断加强入境检验，并启动对我国出口花生产地的调 查程序，公布调查报告，多次发布禁令，并于2002年 2月对我花生采取特殊严检措施，不仅使我输欧花生 严重受限，而且极大影响了欧盟消费者对我花生安全 质量的信任，导致我花生出口贸易竞争力急剧下降。 仅2000年一年就有四十多个批次的花生被销毁或降低 等级。黄曲霉毒素 是真菌毒素的重要代表之一，是由黄曲霉、寄 生曲霉和集峰曲霉产生的一组结构类似，对肝 脏剧毒，并有致畸、致突变和致癌作用的天然 污染物。已发现AF的衍生物有20多种，其中 ，被国际癌症研究机构列为I级致癌剂的AFB1 毒性最大，低剂量长期

5、摄入或大剂量一次暴露 均可引发多种动物肝脏发生癌变或急性中毒。 国际上以黄曲霉毒素、苯并毒性作用作为10 ，000，别的物质与之相比。黄曲霉毒素 原发性肝细胞癌在美国及西欧一些国家 非常罕见，却是非洲及东南亚地区常见 的恶性肿瘤。在我国，原发性肝细胞癌 年发病人数为110200人，占世界总病 例数的45%。其地理分布资料显示，高 发区位于江苏、浙江、福建、广东及广 西等气候条件适于黄曲霉生长繁殖、具 有亚热带气候特点的东南沿海岸线。 黄曲霉毒素 迄今为止，该病的病因尚未明了， 其发病与 多种因素有关，其中膳食暴露AFB1作为一重 要的危险因子已引起世界的广泛注意。来自中 国、肯尼亚、莫桑比克、

6、瑞典、泰国及菲律宾 的研究结果表明，膳食低剂量长期暴露AFB1 与人类原发性肝细胞癌呈正的剂量反应关系。 与城区相比，该病的发生在以谷物为膳食主要 来源的农村更为常见，且有年轻化的趋势，严 重威胁居民的身体健康。 黄曲霉毒素 结构类似的一组化合物，均为二呋喃香豆素（ difuranocoumarin）的衍生物。虽然AF的衍 生物有20多种，目前已分离鉴定出的AF包括 AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、AFM1、 AFM2、AFP1、AFQ、AFH1、AFGM、 AFB2a和毒醇等12种，但天然污染粮油食品 的AF是B组和G组两大类，即AFB1、AFB2 、AFG1和AFG2。 黄曲霉毒素

7、 奶牛摄食被AFB1和AFB2污染的饲料后 ，在牛奶和尿中可检出其羟基化代谢产 物AFM1和AFM2。AFM1除了随乳汁排 出外，还有部分存留在肌肉中。饲料中 的AFB1约有1-6%在奶牛体内转化成 AFM1出现在牛奶中。 黄曲霉毒素 AFB1难溶于水，易溶于甲醇、丙酮和氯 仿等有机溶剂，但不溶于石油醚、己烷 和乙醚中。一般在中性及酸性溶液中较 稳定，但在强酸性溶液中稍有分解，在 pH 9-10的强碱溶液中分解迅速，但此 反应可逆，即在酸性条件下又能恢复原 来结构。 黄曲霉毒素 AFB1对热非常稳定, 268-269方可 破坏, 故一般烹调温度不破坏其毒性。 某些化学试剂如5%次氯酸钠和丙酮可

8、使 AFB1完全分解，因此在实验室中用此方 法对接触过AFB1的器皿作解毒处理。但 在紫外线照射可使之分解。 黄曲霉毒素 AFB1和AFB2在紫外光下可产生蓝紫色 荧光, AFG1和AFG2则产生黄绿色荧光 ，该特性是检测粮油食品中黄曲霉毒素 的重要依据。 黄曲霉毒素 AF分子中的二呋喃环是产生毒性的重要 结构基础，而香豆素可能与致癌作用有 关，AF的毒性、致突变及致癌作用由强 到弱的顺序依次为AFB1 AFG1AFM1AFB2AFG2。 黄曲霉毒素黄曲霉毒素B1黄曲霉毒素黄曲霉毒素B2黄曲霉毒素黄曲霉毒素G1黄曲霉毒素黄曲霉毒素G2黄曲霉的生长 自然条件下，黄曲霉生长繁殖及产生AF 所需要的

9、温度范围为1242，最适 温度为2532，最低相对湿度为 80%左右。该数值相当于小麦、玉米和 高粱中水分含量为18.0%18.5%、稻 谷为16.5%、大米为17.5%、大豆为 17%18%、花生及其他树果为 9%10%。 黄曲霉的生长 黄曲霉生长所需的条件决定了该菌是全 世界分布最广的菌种之一，在我国各省 均有分布。而寄生曲霉从美国夏威夷、 阿根廷、巴西、荷兰、印度、印度尼西 亚、日本、约旦、波兰、期里兰卡、土 耳其、乌干达等国的农作物中分离出。 黄曲霉的生长 我国广西、江苏、江西、湖北、黑龙江、山东 、安徽、湖南、陕西、吉林、辽宁、河南、河北、四川、浙江和甘肃共17个省粮食中分离 到的黄

10、曲霉菌株的产毒性能进行了研究，结果表明，除甘肃省外，其他16个省均分离出产 AFB1菌株，分布情况是，华中、华南和华东 地区产毒菌株多，产毒量也高，产毒在10 mg/kg 以上的强毒株占10%以上。东北和西 北地区产毒株较少，产毒量也低，可能与当地寒冷的气候条件有关。 黄曲霉的生长 在实验的1660株黄曲霉中，来自广西的145 中有86株（59.3%）产毒，其中23（15.9% ）株为强毒株,产毒量最高者达400 mg/kg， 从产毒菌株数和产毒量上均为全国之最。该研 究结果与17省区粮油食品中AFB1的污染水平 和原发性肝癌的发病率呈正相关关系。Gabal 等报道，产毒的黄曲霉中有40的菌株

11、可同 时产生AFB1、AFB2、AFG1和AFG2。 黄曲霉的毒性 许多学者证明黄曲霉毒素不但引发动物 急性中毒症，而且长期少量膳食暴露可 引起实验动物的癌症。这一结果的发现 极大地推动了对食品中常见真菌代谢产 物的研究，并在食品毒物学方面开辟了 新领域。 黄曲霉的急性毒性 各种动物对AFB1的敏感性依动物的种类、年 龄、性别、营养状况等不同而异。动物的AF 中毒主要表现为食欲不振、体重下降、生长迟 缓、繁殖能力降低、产蛋及产奶量减少等。中 毒病变主要在肝脏，表现为肝细胞变性、坏死 、出血、胆管增生等。急性中毒后期，动物出 现体温升高、血性腹泻、心脏出现出血瘀点和 淤斑、胆囊壁增厚、门脉周围纤

12、维化、肝淋巴 结节形成及空泡形成、胆管增生等。此外动物 抵抗力降低，对细菌、病毒及寄生虫疾病更敏 感。 黄曲霉的生殖毒性 Ankrah等(1993)每日经饲料给妊娠小鼠0.8 ng/kg bw的AFB1和4.8ng/kg bw的AFG1或 同时给与AFB1和AFG1 , 出生后的仔鼠继续 给相同剂量的毒素直至6月龄。AFG1实验组 动物肝脏中性脂肪显著蓄积, 血清甘油三酯稍 稍升高, 肝和肾出现严重炎症、坏死和胆管增 生；而AFB1可引起肝脏中性脂肪和脂肪酸蓄 积，显示AFB1对肝和肾细胞的毒性作用。虽 然AFG1的水平是AFB1的6倍，试验结果显示 AFB1对肝肾的毒性作用比AFG1严重得多

13、。 黄曲霉的遗传毒性 Marquez-Marquez（1993）通过检测周围 血中的微核和姊妹染色体交换两项指标对经氨处理的AFB1的基因毒性进行评价。实验中分 别给大鼠和小鼠一次剂量为0.01g/kg bw至 1.0g/kg bw的AFB1，结果显示, 给予 0.1g/kg bw以上水平AFB1 的大鼠，骨髓染 色体畸变率和微核率明显升高，而小鼠仅最高剂量组(1.0g/kg bw)染色体畸变率稍有升高 。在AFB1最高剂量组中，大鼠染色体畸变率 比小鼠高10倍，说明大鼠对AFB1明显比小鼠 敏感。 黄曲霉的致癌性 由于黄曲霉毒素具有基因毒性，可使基 因发生突变，由此导致动物细胞发生畸 变、诱

14、变及癌变，AF是目前已知的最强 的致癌物。大量研究表明，长期低剂量 或短期摄入较大剂量的AF均可诱发大鼠 、小鼠、豚鼠、雪貂、鸭雏、狗、猫、 兔、猴等动物原发性肝癌，其中以大鼠 和鳟鱼最敏感。 黄曲霉的致癌性 动物实验已证明AFB1可诱发多数动物发生原发性肝 癌。大量的流行病学调查表明，AFB1暴露量与肝癌 发病的增加有相关性。 在肝癌发病率高的地区如非洲 、东南亚及中国南方某些地区，当地食品严重污染AFB1。AFB1在人和实验动物体内被代谢成一种环氧 化物，这种环氧化物被认为是最终反应的中间体。有 一些证据表明对人的实际危险性比实验动物低，JECFA通过流行病学调查发现并, AFB1只有在其

15、他 因素（例如乙型肝炎病毒感染）存在的情况下才能造 成危害。目前正在连续进行的研究可以进一步提高评估摄入AFB1对人类造成危害的可靠性，最值得注意 的是上海、泰国和启东的研究以及冈比亚、台湾和启 东进行的乙型肝炎疫苗的试验，这些研究项目完成后，委员会可能要对AFB1对人类的危害重新评价。黄曲霉的致癌性 有一些因素影响原发性肝癌的危险性, 其中最明显的是经确定血清中含有乙肝 病毒表面抗原的携带乙肝病毒者，在同 时患有乙型肝炎病人,AF的作用明显增 强。这种相互作用的现象，使流行病学 研究很难把AF看作是单一的主要的危险 因素。对农作物的污染 AF对农作物的污染以花生及其制品（如 花生油、花生酱）

16、、玉米、大米和棉籽 为重。除此之外，坚果类如核桃、杏仁 、椰肉、奶及奶制品、动物肝脏、干咸 鱼及辣椒等也不同程度地受到黄曲霉毒 素的污染。 黄曲霉毒素的分析微柱法 萃取液经过氟罗里硅土微柱，用三氯甲 烷丙酮（9：1）洗脱，被吸附的黄曲 霉毒素在紫外灯下有蓝紫色的荧光。 与标准柱对照进行半定量分析。黄曲霉毒素的分析薄层色 谱法 多年来广泛用于黄曲霉毒素的分析。 半定量分析。黄曲霉毒素的分析液相色 谱法 近年来广泛用于黄曲霉毒素的分析，常 用的反相色谱柱均可使用。如Shim Pak，hypersil, Radialpak, Bondapak,TSK_GEL ODA 80TS等。提取 乙腈水或甲醇水，比例为84 85+1516 即可。 提取方法 样品与提取溶剂一同搅拌，超声提取或 样品粉碎后振荡提取均可。 提取方法和时间要根据具体情况定，不 能一概而论。 霉菌毒素的提取效果与粒径大小密切相 关，粒径越小效果越好。净化 硅胶 C18