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1、广东医学院2003级 硕士研究生开题报告p16在宫颈癌发生中的作用及 其机制的研究 n 研究生： 邓飞n 导师： 胡新荣 教授n 时间： 2004年10月22日 立题依据n肿瘤的发生是一个多因素、多步骤的长期过程 ，其中多个基因的改变导致细胞周期失调，细 胞增殖失控在肿瘤形成的过程中发挥了重要作 用。np16基因又称MTS1（多肿瘤抑制基因）是人们 发现的第一个直接作用于细胞周期，抑制细胞 分裂的基因。np16在诸多肿瘤中的改变，使它在肿瘤发生中 的作用日益受到人们的重视。一、p16的基因结构和功能 1、p16的基因结构 np16基因定位于9p21，全长8.5kb，由三 个外显子和两个内含子构
2、成，三个外显 子的长度分别为126、307、11bp，其 cDNA全长450bp。p16基因启动子和外显 子1、2含有多个可甲基化的5CpG岛 。np16基因编码产物p16蛋白，由148个氨基 酸构成，为16kd 2、p16的功能RB E2FRBPPPPE2FINK4Ap16cyclinD1CDK4/6P CDKcyclinD1CDK4/6cyclinD1CDK4/6CDK4/6 P 竞争性抑制二、p16与肿瘤 n研究表明，p16基因的缺失、突变和甲基 化存在于多种人肿瘤细胞，提示其与肿 瘤的发生、发展有着密切的关系。 np16除了调节细胞周期，抑制细胞异常增 殖以外，还与肿瘤细胞中端粒酶活性
3、的 调节和肿瘤细胞的永生化有关。 n大量的实验证据使人们相信在大多数肿 瘤中p16扮演者抑癌基因的角色。三、p16与宫颈癌 n宫颈癌是妇女常见肿瘤之一，其发生机 制尚不清楚。对于p16与宫颈癌关系的研 究，已成为近几年来宫颈癌发生机制研 究中的热点。 n同在大多数肿瘤中一样。p16基因也被认 为在宫颈癌发生中的扮演着抑癌基因的 角色，其主要依据有 ：n1、宫颈肿瘤组织中，普遍都能检测到 p16基因的失活。n2、p16基因及其编码蛋白在体外实验中 能抑制宫颈癌细胞系的生长。然而，在对p16的进一步研究中，人们用免 疫组化检测临床病例标本的p16蛋白表达 后发现，p16蛋白的表达会随着宫颈癌病 情
4、的进展而呈现逐渐升高的趋势 。这一发现使人们对p16在宫颈癌发生中的作 用产生了疑问： （1）p16在宫颈癌发生过程中起什么作用 ，是否与在其他肿瘤中一样起着抑癌作 用。 （2）如果p16是抑癌基因，为什么其失活 率随宫颈癌的发生而逐渐增加的同时， 表达也逐渐升高。 以上问题迄今为止，都还没有得到满意合 理的解释，国内也缺乏此类相关研究。 本实这些验即是针对以上问题展开初步 的探讨。实验目的 1、研究p16在宫颈癌的发生过程的表达趋 势。 2、研究p16在宫颈癌发生中的作用及机制 。 拟解决的关键问题1、p16在宫颈癌发生过程中表达是否升高 。 2、高表达的p16与cyclinD1竞争性结合
5、CDK4/6的能力是否改变。 3、p16高表达与pRb磷酸化的关系。 4、体外实验中p16表达对cyclinD1与 CDK4/6的结合能力及pRb的磷酸化水平的 影响。 拟采取的研究方法（1）IHC （2）CO-IP、IP、western-blot （3）siRNA转染宫颈癌细胞系技术路线 一、临床实验1、p16表达的检测：临 床 病 例 标 本切片、HE同一组织来源不同组织来源癌前病变宫颈癌癌前病变宫颈癌p16P16 的 表 达 趋 势图像 分析IHC2、p16功能检测p16高表达的宫颈癌标本 P16低表达的宫颈癌标本 提取组织块 中的蛋白质p16-CDK4/6 pRb-P 对比不同组结果，
6、 研究p16表达与pRb磷酸化的关系 对比不同组的 结果，研究p16 表达升高对其 功能的影响。CO-IP、 westernIP western二、体外实验p16高表达的 宫颈癌细胞筛选p16表达缺失的宫颈癌细胞 CyclinD1-CDK4/6pRb-P CyclinD1-CDK4/6 pRb-P CO-IP、IP、western-blot 对比分析 得出结论siRNA腺病毒转染预期结果 n1、p16在宫颈癌的发生过程中表达逐渐 升高。 n2、临床实验中，p16高表达组比低表达 组，p16与CDK4/6的结合增加，pRb的磷 酸化水平升高。n3、体外实验中，转染前后，cyclinD1与 CDK4/6的结合增加，pRb的磷酸化水平降 低，进度安排 n2004.102005.7 临床病理标本的收集 。细胞系的筛选，细胞转染及转染后筛 选。n2005.82006.1 IHC、CO-IP、IP、 western-blot。n2006.22006.4 结果分析，撰写论文 ，准备答辩。经费预算 n免疫组化 2000元n免疫沉淀 5000元nWestern-blot 3000元n细胞培养 2000元nsiRNA转染 25000元*n总计 37000元
