基因工程原理-第一章绪论

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1、基因工程原理Principle of Gene Engineering第一章 第一节基因工程原理第一章 基因研究的发展阶段：染色体遗传学分子生物学反向生物学50s70s染色体水平DNA水平DNA重组1909年，丹麦W. Johannsen，Gene专业名词诞生，“给予生命”18571864：孟德尔碗豆杂交试验（遗传因子的独立分配规律）1910年：摩尔根果蝇遗传学研究（遗传的染色体理论）1944年：Avery细菌转化实验（基因的化学本质是DNA）1953年：Watson-Crick DNA双螺旋模型学习内容概论DNA重组（限制性内切酶）运输工具基因克隆载体目的基因的制备目的基因导入受体细胞外源基

2、因的表达基因工程的应用第一章 第一节基因工程原理基本要求掌握基因克隆的基本工具，特别是不同的载体。克隆基因的基本方法。怎样利用基因重组技术研究基因的结构、表达和调控。利用基因工程生产重组蛋白，基因工程在医药和农业上的应用。能够设计一个基因克隆的程序。PCR技术基本原理和应用能够根据酶切结果判读酶切图谱，以及判读DNA序列的能力。 第一章 第一节基因工程原理基因工程，龙敏南 等著，科学出版社，普通高等教育“十一五”国家级规划教材参考书Gene cloning, T.A. Brown. Third edition.基因工程原理，吴乃虎编著，科学出版社基因工程概论，张惠展编著，华东理工大学出版社。植

3、物基因工程原理与技术，王关林，方宏筠主编，科学出版社。分子克隆实验指南，J. Sambtook, EF Frish, T Maniatis, 金冬雁，黎孟枫等译，科学出版社。第一章 第一节基因工程原理第一章 绪论基因工程概况1.1引言1.1.1基因工程含义指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其它载体分子 ，构成遗传物质的新组合，并使其掺入到原先没有这类分子的 寄主细胞内，而能持续稳定繁殖。基因工程英文：genetic engineering, gene manipulation, recombinant DNA technique, gene cloning, molecular cloning

4、 目的基因的制备DNA重组（限制性内切酶）运输工具基因克隆载体目的基因导入受体细胞外源基因的表达基因工程：在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，并使其掺入到原先没有这类分子的寄主细胞内，而能持续稳定繁殖。关键要素：1.1.2 基因工程理论依据基因具有相同的物质基础：DNA基因可切割基因可转移多肽基因遗传密码通用性：三联密码基因遗传1.1.3 基因工程研究的基本路线基因工程：在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，并使其掺入到原先没有这类分子的寄主细胞内，而能持续稳定繁殖。1.1.4基因工程发展史（1）理论上的三大发现：1944, Ave

5、ry的肺炎双球菌实验,确定了遗传的物质基础是DNA。DNA的分子结构及复制机理：50年代，Watson和Crick提出 DNA的双螺旋结构模型和半保留复制的机理。1958，Crick提出“中心法则”；1961年，Jacob和Monod “操纵 子学说”DNARNA-蛋白质阐明了遗传物质的流向和表达问题。1.1.4基因工程发展史（1）理论上的三大发现：1944, Avery的肺炎双球菌实验,确定了遗传的物质基础是DNA。DNA的分子结构及复制机理：50年代，Watson和Crick提出DNA的双螺旋结构模型和半保留复制的机理。1958，Crick提出“中心法则”；1961年，Jacob和Mono

6、d “操纵子学说”DNARNA-蛋白质阐明了遗传物质的流向和表达问题。1.1.4基因工程发展史（1）理论上的三大发现：1944, Avery的肺炎双球菌实验,确定了遗传的物质基础是DNA。DNA的分子结构及复制机理：50年代，Watson和Crick提出DNA的双螺旋结构模型和半保留复制的机理。1958，Crick提出“中心法则”；1961年，Jacob和Monod “操纵子学说”DNARNA-蛋白质阐明了遗传物质的流向和表达问题。DNA分子的体外切割与连接技术 1970年，Smith等在流感嗜血杆菌中分离纯化了核酸限制性内切酶 Hind；1972年，EcoR 。DNA分子的核苷酸序列分析技术

7、基因工程载体pBR322和pUC13等载体。Cohen发现质粒pSC101，并作为基因工程的载体使用.（2）技术上的三大发明：（3）基因工程的诞生猿猴病毒SV40 DNA 噬菌体 DNAEcoR I切割T4 DNA连接酶重组DNA分子1972年,美国斯坦福大学的 P.Berg 第一次实现了DNA 体外重组。1973年，Cohen等获得了抗四环素和新霉素的重组菌落TcrNer，标志着基因工程的诞生：Tetracycline pSC101EcoR IDNA 连接酶Kanamycin R6-5Kanr 和 Tetr重组质粒转化大肠杆菌 Cohen体外重组实验的意义：1. pSC101质粒可以作为基因

8、克隆的载体.2. 能够将外源DNA导入寄主细胞.3. 质粒-大肠杆菌是一种成功的基因克隆体系.1977年，E. coli中合成了人生长激素基因。1978-1979胰岛素基因在大肠杆菌中表达。 1982年，培育出了超级鼠。1985年Horsch发明了植物基因工程的基本方法：叶圆盘法，并获得转基因植株。1990年，患有遗传免疫疾病的4岁女孩接受了基因疗法。1990年，Perlak 将B.T.基因导入棉花获得抗虫棉 。1991年，美国开始人类基因组计划。1997年，“多利”绵羊诞生。（4） 发展过程中的重大事件转移大鼠生长素基因的小鼠 1.2 基因工程研究内容目的基因分离制备重组DNA分子重组DNA

9、分子转移到适当的受体细胞筛选出获得了重组DNA分子的受体细胞克隆提取已扩增的目的基因目的基因克隆到表达载体上，表达，产生目标产物第一次课结束琼脂糖凝胶电泳(0.2-50kb DNA) 聚丙烯酰胺凝胶电泳(1-1000bp DNA)1.3 基因操作的基本技术（1）凝胶电泳：一种分子放置在电场中,会以一定的速度移向适当的电 极。凝胶的分辨能力:凝胶的类型和凝胶的浓度有关凝胶电泳的作用:分析,制备和纯化溴化乙锭:简称EB.EB的工作原理：溴化乙啶插入的EB-+电 泳 方 向EB分辨率：0.05g/带原理:带有互补的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA混合，互补区段会退火形成双链结构。（2）核酸的分子杂

10、交 1968年华盛顿卡内基学院 Roy Britten等常见的分子杂交：Southern blotting： DNA， DNA/RNA Northern blotting： RNA， DNA/RNADot/slot blotting：DNA芯片in situ hybridization：组织原位杂交Western blotting：蛋白质/抗原、抗体待测分子探针Southern Blotting杂交:总DNA分子酶切DNA片段电泳变性、转移到滤膜上用32P标记的 DNA探针杂交洗脱放射 自显影（核酸印迹）（印迹杂交）1975年，英国人Southern创建，是研究DNA图谱的基本技术。South

11、ern印迹杂交显色图片 用途：确定DNA 大小，鉴定DNA转化结果。Northern Blotting杂交:1979年，J.C.Alwine等，应用于特定性状基因在mRNA水平上的动态表达研究。流程：RNA混合物进行琼脂糖凝胶电泳分离得到的RNA转膜与放射性 标记的探针杂交 结果分析（3）细菌的转化（Transformation）一种细菌菌株由于捕获了来自另一种细菌菌株的DNA，而导致性状特征发生遗传性改变的生命过程。双脱氧链终止法（Sanger法）：英国生物化学家Frederick Sanger于1977年发明（4）DNA核苷酸序列分析模板 标记的引物 DNA聚合酶 dNTP 双脱氧链终止物

12、ddNTP反应组成检测方法：电泳放射自显影读出DNA序列长度：250bpSanger法基本过程 ：*CGTACCTCGTTCATGACAAGCGTCTCAddGAGTddCGCAGAGT ddTGTTCGCAGAGTddACTGTTCGCAGAGT* *DNA Sequencing via the Sanger Method模板 标记的引物 DNA聚合酶 dNTP 双脱氧链终止物ddNTPFrederick Sanger 1918年8月13日2013年11月19日，英国生物化学家。是第四位两度获得诺贝尔奖，以及唯一获得两次化学奖的人。1958年：确定胰岛素结构，获得诺贝尔化学奖1980年：发明

13、Sanger测序法，再诺贝尔化学奖化学降解法(Maxam-Gilbert法）：250bp1977年，A.M.Maxam和W.Gilbert建立的DNA片段序列的测定方法DNA分子末端放射性标记电泳四个独立的降解体系放射自显影G反应：G甲基化（硫酸二甲酯） G+A反应：A和G质子化（甲酸） T+C反应：T和C嘧啶环断裂（肼） C反应：C嘧啶环断裂（高盐、肼） DNA序列分析仪聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR ）1985年，美国，Mullis：体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法。成果发表在Science上。（5）基因扩增（gene amplificat

14、ion）1993年因发明PCR技术，与迈克尔史密斯分享诺贝尔化学奖Kary Banks Mullis，1944年12月28日“我感谢诺贝尔评奖委员会,在我还能够尽情享受生活的年龄及时地把诺贝 尔奖授予给我.”“Fish dont know much about water, and people didnt know much about air.”“Play! Experiment! Discover!”基本原理： 高温变性低温退火中温延伸1.4 基因克隆需要特殊的工具和技术运输工具：细菌质粒病毒染色体DNA操作技术纯化DNA剪切DNA分子分析DNA片段大小连接DNA分子将DNA转入受体细胞

15、重组子的鉴定1.5 基因工程的意义大规模的生产生物分子设计构建新物种搜寻、分离和鉴定生物体尤其是人体内的遗传信息。医药 重组药物 基因治疗 检测遗传疾病、病原 农业 抗病虫 提高品质 提高花卉的观赏价值 抗逆性 家畜：瘦肉比；饲料利用率；加快生长主要基因工程产品的研制、开发、上市时间产品时间国家用途上市时间国家人生长激素释放抑制素(SRM)1977日本巨人症人胰岛素1978美国糖尿病1982欧洲人生长激素（HGH）1979美国侏儒症1985美国人-干扰素（IFN）1980美国病毒1985欧洲乙肝疫苗（HBsAgV）1983美国乙肝1986欧洲人白细胞介素1984美国肿瘤1989欧洲人促红细胞生成素（EPO）日本贫血1988欧洲人粒细胞集落刺激因子(G-CSF)白血病1991美国人组织纤溶酶原激活剂（t-PA）血栓症1987 美国第二次课结束