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1、第六节 重组体的筛选与鉴定 转化子：接纳载体或重组分子的转化细胞。 重组子：含有重组DNA分子的转化细胞。外源DNA载体DNA重组分子原核细胞真核细胞扩增或表达表达连接转化或转导电穿孔或显微注射受体细胞DNA的体外重组植物转化体报道基因筛选法（1）大肠肠杆菌的-D-葡萄糖醛酸糖苷酶（-D-glucuronidase，GUS）； （2）细菌和萤火虫的荧光素酶（luciferase）； （3）水母绿色荧光蛋白（GFP）基因（Green Fluorescent Protein）。1. 报告基因（reporter gene)（4）其它几种报道基因的作用原 理4-甲-D-葡糖醛酸荧光产物GUSGFP紫外
2、光照 发绿色荧光5-溴-4-氯-3-吲哚-D-葡糖醛酸蓝色水解产物GUSFireflies emit light catalyzed by luciferase with ATP转入萤 火虫的 luciferas e的烟草一、遗传检测法报告基因筛选、抗性标志插入失活筛选、半乳糖苷酶蓝白斑筛选、插入基因遗传性状筛选、 二、分子检测法PCR扩增检测分子杂交检测 三、物理检测法DNA电泳检测限制酶酶切分析法 四、免疫化学检测法 五、核酸序列分析平板筛选重组子的筛选与鉴定一、遗传学检测法重组体的筛选与鉴定-筛Ampr1.插入失活筛选:例1 在Tetr中插入目的基因在质粒固有 的功能基因 内插入目的 基
3、因，则该 基因不能表 达有功能的 蛋白质。原理：AmpTet1 2 34 5 63和5 是阳性克隆1 2 34 5 6两种抗生素直接筛选（影印法）无环丝氨酸培养基环丝氨酸辅助筛选（1）四环素：抑制细菌生长，但不杀死细菌。（2）氨苄青霉素抗性基因：产生-内酰胺酶， 使氨苄青霉素转变为青霉酮酸pBR322抗菌素标记选择原理（3）环丝氨酸：杀死生长的细菌，但不杀死停 止生长的细菌。如果在Tetr上插入外源DNA，导致四环素抗性基 因失活，可用四环素加环丝氨酸平板培养基选 择重组克隆。Tetr失活的菌生长被四环素抑制，不被环丝氨酸杀死，保 留下来；Tetr不失活的菌抗四环素，能分裂生长，反而被 环丝氨
4、酸杀死。pUC18/191.插入失活筛选:例2 在Lac Z中插入目的基因载体上带有一个来自大肠杆菌的lac操纵子的DNA区段，可 编码-半乳糖苷酶氨基端即肽链， IPTG可以诱导该片段 的合成，而该片段能与宿主细胞所编码的-半乳糖苷酶羧基端 互补(-互补)。故暴露于诱导物IPTG的细菌含有编码lacZ的质粒可同时合成 该酶的两种片段，该菌在其生色底物X-gal的培养基上生长形成 蓝色茵落。将一连串克隆位点克隆入质粒的lacZ基因中，外源DNA插入 质粒的多克隆位点后可使-半乳糖苷酶的氨基端片段灭活，从 而破坏了-互补作用。因此，带有重组质粒的细菌将产生白色 菌落。 利用这种筛选方法可方便地将
5、含目的基因的重组子从空载体中 筛选出来。这种现象被称为是 -互补 X-Gal：5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷 IPTG:(异丙基-D-硫代半乳糖苷)-互补 (alpha-complementation)lacZ与蓝白斑筛选-互补 (alpha-complementation)通过看培养皿上的菌斑的颜色就能直接知道 是否有DNA插入。MCS无插入时，互补，蓝菌斑。 MCS有插入时，不互补，白菌斑。IPTG诱导的结 果：无质质粒的 受体菌-半乳糖苷酶 部分缺失，不 能分解Xgal； 无抗菌素抗性在含抗菌素和Xgal的培养基上培养无菌斑 生长长质质粒转转化 的受体菌-半乳糖苷酶的 缺失被载载
6、体产产 物互补补，能分 解Xgal。且有抗 菌素抗性在含抗菌素和Xgal的培养基上培养有蓝蓝色 菌斑生 长长带带外源DNA插 入的质质粒转转化 的受体菌载载体产产物失 活，不能互补补 -半乳糖苷酶 的缺失。不能 分解Xgal，但 有抗菌素抗性在含抗菌素和Xgal的培养基上培养有白色 菌斑生 长长利用插入的外源基因的表达产物特性进行直 接选择。（只在特定条件下）。转化进来的外源基因产物能够弥补受 体菌株的突变型缺陷。一、原理：2、 根据插入基因的遗传表型筛选弥补缺陷his- his+受体菌： 外源基因：在不含组氨酸的 培养基中生长利用有插入片段的重组载体的分子量比野生型载体分 子量大。一、直接电
7、泳检测法从转化后的菌体克隆中分离 质粒，电泳、比较其分子量 。DNA电泳检测法 分子量 Marker载体重组克隆三、物理检测法根据重组DNA分子大小鉴定重组子原理：有外源DNA片段插入载体后的 重组DNA与载体DNA之间的大小差异。基本方法：提取转化子的DNA，经琼 脂糖凝胶电泳分离，电泳迁移慢的带是重组 DNA的带。此法是对重组子进行分析鉴定的最基 本、最简单的方法，只适用于重组子的初步 鉴定。二、酶切电泳筛选法1. 原理：根据已知的外源DNA 序列的限制性酶切图 谱，选择一两种内切 酶切割质粒，电泳后 比较电泳结果（DNA 带数和长度）。或用合适的内切酶切下 插入片断，再用其它酶 切这个片
8、断，电泳后比 较结果是否符合预计的 结果。二、分子检测法PCR扩增检测分子杂交检测PCR扩增检测法1. 原理PCR能在模板序列上扩增出预期DNA片断。2. 过程（1）从重组克隆中提取质粒（或DNA）。 （2）用外源DNA插入片断作PCR引物。 （3）电泳PCR产物。 （4）检查是否有PCR产物。（5）PCR产物的长度是否与外源基因一致。补充例 PCR检测PCR检测外源基因的原理是根据被转移的外源基 因（目的基因或选择标记基因）设计引物，扩增外源 基因的片段。如果扩增出的片段与设计的一对引物之 间的实际片段在长度上相吻合，说明基因已转入受体 细胞。 在进行PCR检测时应设两个对照：阳性对照即质粒
9、 DNA和阴性对照即非转基因材料的DNA。 PCR扩增结果只能初步确定转基因材料的真实性， 并不能完全确信。容易出现假阳性，通常需要进一步 用Southern杂交才能证实。转基因棉花选择标记基因NPTII编码区段的 PCR扩增结果（M为分子量标准，C为非转 基因植株，P为质粒对照，1-20为转基因植 株） 具有互补序列两条单链核酸分子在一定条件下 按碱基互补配对原则退火形成双链的过程。 杂交的双方是待测核酸和已知核酸序列，已知 核酸序列且已标记的DNA或RNA,称探针。 杂交有固一液相杂交和液相杂交。 核酸分子杂交的基本原理四、核酸分子杂交技术变性变性复性复性DNA-DNA 杂交双链分子2.1
10、 探针（Probe)的概念:一段带有检测标记的与目的基因或目的DNA特异互补的已知核苷酸序列。四、原位杂交1、定义：将标记的核酸探针与固定在细胞或组织中的核酸进行杂交，称原位杂交。根据探针与待检核酸分：DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA 杂交（1）菌落印记原位杂交筛选特点： 对应的菌斑或噬菌斑位置不变， 可以直接找出阳性菌落。用DNA（或RNA）探针检测DNA样品。Southern blotting从宿主细胞中提取DNA（或质粒载 体），再用探针杂交。只有带有插入片断的重组载体才能 与探针杂交，在底片上曝光显示。Paper TowelsSouthern Blottingtissue
11、SDS蛋白酶K酚/氯仿无水乙醇离心2. Northern blotting 用DNA（或RNA ）探针检测RNA 样品。主要检测插入片 断是否被转录。从宿主细胞中提 取RNA，再用探 针杂交。此技术由Southern 1975年首先设 计。被检测对象为DNA。 4.1 Southern 印迹杂交带有DNA片段的凝胶DNA分子限制片段限制性酶切割琼脂糖电泳至膜（尼龙膜或硝酸 纤维素滤膜）上转膜杂交、显影凝胶滤膜用缓冲液转移DNA吸附有DNA 片段的膜Southern 印迹杂交的技术流程白瓷盘玻璃板滤纸凝胶尼龙膜滤纸吸水纸玻璃板重物吸水纸转膜。真空转膜槽滤纸尼龙膜凝胶盖子+-真空转膜利用抗体作为“
12、探针”来检测转入受体菌并 且表达出相应的蛋白质的外源基因。根据第一抗体（一抗）和第二抗体（二抗 ）的性质可分为几种作用方式：一、放射性抗体检测法一、放射性抗体检测法第五节 免疫化学检测法 1. 抗体与产物的结合方式对表达产物的检测。蛋白蛋白“杂交”待测基因 产物蛋白一抗二抗125I 标记的二抗结合蛋白固相支 持滤膜待测基因 产物蛋白一抗125I标记的二抗固相支 持滤膜待测基因 产物蛋白一抗固相支 持滤膜固相支 持滤膜待测基因 产物蛋白一抗 二抗125I 标记的二抗结合蛋白125I标记的二抗2. 放射性抗体检测法 过程3. Broome-Gilbert双位点检测法质粒基因A插入基因B表达质粒蛋白
13、A 外源蛋白B融合蛋白检测融合蛋白。既检测外源基因产物又检测载体基因产物。固相支 持滤膜抗A抗体125I标记的 抗B抗体质粒蛋白A 外源蛋白B质粒蛋白A外源蛋白B固相支 持滤膜抗A抗体发光，底片曝光二、免疫沉淀检测 法把非放射性抗体加到平板培养基中， 当插入基因的表达产物被细菌分泌到 菌落周围时，就会与抗体反应形成“沉 淀圈”。1. 原理 抗原抗体凝集反应。检测分泌型产物。2. 方法对于不能被分泌到菌体外的蛋白质可先进行 原位溶菌处理（溶菌酶、原噬菌体诱发）。三、酶联免疫吸附测定（ELISA）Enzyme-linked immunosorbant assay1. 原理：一抗（primary a
14、ntibody）:与目标分子的特异结合。 二抗（secondary antibody）：与一抗的特异性结合。 酶连（enzyme-linke）：二抗上携带一种酶能催化一种反应将无 色的底物转变为有色的物质（或发光），再 通过比色测定有色物质的含量（或光强度） ，从而推测目标分子的含量。待测基因 产物蛋白一抗二抗酶待测基因 产物蛋白一抗 二抗无色的底物有色的产物比色观察酶192. ELISA检测的一般步 骤 （1）固定样品将待测样品加入96孔微量滴定板（ microtiter plate）的孔中，干燥后就 被固定在孔底。孔底加入一抗，反应后冲洗掉未结合的抗体。（2）一抗结 合一抗加入二抗，与一抗
15、结合后再将未结合的二 抗冲洗掉。二抗只识别一抗。二抗上联着一种酶（碱性磷酸酶、过氧化物 酶、脲酶等）。（3）二抗结 合二抗加入无色的底物，被二抗上所带的酶催 化反应转变成有色物质（或发光）。（4）显色反 应在特殊的分光光度仪（酶标仪）上比色，打 印出结果。（5） 比色3.ELISA的局 限性 有效，但准确性稍差（主要取决于一抗 的特异性）。 必须与其他方法一起综合考虑。最好用单克隆抗体（monoclonal antibody）临床检验常用的 单抗四、免疫印迹（western blotting） 法1.原理：在蛋白质凝胶电泳以后，用转膜和免疫的方 法检测胶上的蛋白质泳带。（1）SDS聚丙烯酰胺凝
16、胶电泳 是蛋白质的变性剂，使煮沸变性的 蛋白质维持线性状态，并与蛋白质 结合，使蛋白质带上负电荷。 SDS:（SDS-PAGE）： 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） ：（Polyacrylamide gel electrophoresis）在电场的作用下线性 蛋白质链在聚丙烯酰 胺凝胶介质中向正极 移动，移动的速率主 要取决于其分子量大 小（链的长短），从 而把不同分子量的肽 链分开。电泳buffer电泳buffer点样电泳方向蛋白质电泳的 分子量标准已知分子量的蛋白质 混合液，与待测样品 一起电泳，为样品蛋 白质提供分子量估计 。 商品化供应Da道尔顿(质量单位, 等于 一氧原子质量的十六分 之一。 一克约为61023道尔顿DaltonSDS PAGE凝胶中的蛋白质染 色：考马斯亮蓝： 灵敏度底、只能检出0.3-1g/带带，但可 褪色回收。硝酸银： 灵敏度高、可检出2-5ng/带。2）转到膜上进行染色
