细胞培养基本技术

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1、细胞培养基本技术细胞培养的甚本概念n 传代：n 细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种 到新的培养器皿中。n 原代培养n 取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长的细胞在 传代之前称为原代培养。n n细胞培养：使用单个细胞悬液n组织培养：使用组织块（O.51立方毫米 ）或薄片（厚0.2 毫米）n器官培养：使用器官原基或器官的一部分 或整个器宫原代培养细胞的生命归宿n原代培养期n传代期n衰退期n有限细胞系，无限细胞系 n细胞系 cell linen细胞株 cell strain 培养细胞的特性n 培养细胞的生长方式n贴附生长：n 必须贴附于支持物表面才能生长。见于各种实体 瘤细胞n悬浮生长：n

2、于悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持物表 面。见于各种造血系统肿瘤细胞每代贴附生长细胞的生长过程n游离期n贴壁期n潜伏期n对数生长期n停止期（平台期）n游离期：n细胞接种后在培养液中呈悬浮 状态也称悬浮期。此 时细胞质回缩，胞体呈圆球形。n10分钟一4小时n贴壁期：n细胞附着于底物上，游离期 结束。细胞株平均在10分钟一4小时 贴壁。n底物：胶原、玻璃、塑料、其它细胞等n血清中有促使细胞贴壁的冷析球蛋白和纤粘素、胶原等糖蛋白（ 生长基质），这些带正电荷的糖蛋白的促贴壁因子先吸附于底物 上，悬浮细胞再与吸附有促贴壁因子的附着。n进口塑料培养瓶涂有生长基质（化学合成的功能基团）n潜伏期n此时细胞

3、有生长话动，而无细胞分裂。细胞株潜伏期一般为624小时。n对数生长期：n细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。n停止期（平台期）：n细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂n机制：接触抑制、密度依赖性培养细胞生长的条件n1 细胞的营养需要n2 细胞的生存环境n 温度: 37 n O2n CO2: 5% CO2 +H2O H2CO3 H+ + HCO3-n pH: 7.2-7.4n 渗透压n 3 无污染n 4 无毒实验准备实验用品：n超净工作台，压力蒸汽消毒器，电热干燥箱，滤器， 酸缸nCO2培养箱n倒置显微镜n酶标仪、微孔板震荡器n液氮罐n自动双重纯水蒸馏器，纯水仪n耗材：培养

4、瓶，吸管，电动吸引器，培养板， 冻存管n压力蒸汽消毒器：湿热消毒，用途广n电热干燥箱：干热消毒（160 ，2小时）。主要用干玻璃n器皿消毒 n滤器：过滤除菌：大多数培养用液，如人工合成培养基、血清 、 n酶液等均采用滤过法除菌 n超净工作台：为细胞操作提供无菌环境n紫外灯 ：紫外线消毒。 主要用于培养室空气、操作台、塑料n培养皿和培养板等表面消毒 超净台n n超净工作台的工 作原理是利用鼓风 机驱动空气遁过高 效滤器除去空气中 的尘埃颗粒，使空 气得到净化。净化 空气徐徐通过工作 台面，使工作台内 构成无菌环境。 滤 器CO2培养箱nCO2培养箱设定的条件为37 ，5CO2 。n使用CO2培养

5、箱培养细胞时应注意的问 题：n 用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖 微松，以保证通气。n 保持培养箱内空气干净。定期消毒n（90 ，14 h)。n箱内火菌蒸馏水3000毫升蒸馏水槽中 以保持箱内湿度，避兔培养液蒸发。自动双重纯水蒸馏器 纯水仪酶标仪 微孔板震荡器培 养 板培养瓶n浸泡（自来水）、刷洗（洗衣粉）、酸泡（24小时） 、n流水冲洗、蒸溜水浸泡和冲洗、50烘干n常用玻璃器皿清洗清洁液的配制水：新鲜配置的三蒸水或去离子水平衡盐溶液：无Ca2+、Mg2+的缓冲液PBS：NaCl 8.0 gKCl 0.2 gNa2HPO4.H2O 1.56 gKH2PO4 0.20加水至1000 ml细胞培养用

6、液的配制n胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健，除去细胞间粘 蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架，从而使细胞分离n胰蛋白酶液浓度越高，作用越强，但超过一定限度会损伤细胞。n胰蛋白酶是一种黄白色粉末，用无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液配制常 用的胰蛋白酶液浓度是0.25 。用滤器过滤除菌。n胰蛋白酶液消化时间：2-10分钟。n用含血清培养液终止其对细胞的消化作用 消化液：培养基n培养基（培养液）是维持体外细胞生存和生长的溶液 ，分天然培养基和合成培养基。n天然培养基：n天然培养基有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液） 。n优点：营养成分丰富，培养效果好n缺点：来源受限。成分复杂，影响对某

7、些实验产物的提取和实验 结果的分析。易发生支原体污染 n合成培养基:n合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和数量， 用人工方法模拟合成的。目前已设计出许多种培养基 ，如TC199、MEM、RPMI-1640、 DMEM等。n合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物 、无机盐和其它一些辅助物质。n优点：标准化生产，组分和含量相对固定。成本低 n缺点： 缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需 要。 n人工合成培养基只能维持细胞生存，要想 使细胞生长和繁殖，还需补充一定量的天 然培养基（如血清）。n血清中含有：n多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等）n多种金属离子； n激素；n促贴附物质，

8、如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等。n各种生长因子n转移蛋白n不明成分n一般说来含5小牛血清的培养基对大多数细胞可以维持细胞 不死但支持细胞生长一般需加 10血清n对于血清支持细胞生长的生物学效应已得到证明，但对血清中的 复杂成分至今尚未完全清楚n血清中不仅存在促细胞生长因子，同对也存在细胞生长抑制因子 或毒性因子，因此在含血清培养基中培养的细胞所反映的生物学 特性是细胞和复杂血清因子的综合反应。n在生长因子、蛋白质工程、基因表达调控等研究领域，迫切需要 用无血清培养基培养细胞n无血清培养基的主要研制策略：在基础培养基中补充各种必需因 子，如激素、生长因子 、结合蛋白 、贴壁和扩展因子 等。n无血

9、清培养基由基础培养基和替代血清的补充成分组成。n1975年，Sato首次成功地用无血清培养基培养了垂体细胞株，近 20多年来已报道了几十种细胞系在无血清培养基中成功地生长和 增殖。n无血清细胞培养基的使用保证了实验结果的准确性、可重复性和 稳定性，减少了细胞污染，简化了提纯和鉴定各种细胞产物的 程序。n向无清培养液中能促进细胞系生长的补加物都是独特的。适用于 某种细胞株的培养液，很可能不适合另一种细胞株的生长。即使 同源组织的不同细胞株，所需补加物也不同。 无血清培养基尚处于研究阶段，难以推广。目前，绝大多数人工合成培养基使用时还需添加血清 n血清质量好坏是实验成败的关键。n常用血清有胎牛血清

10、、新生牛血清、小牛血清、兔血 清、马血清等，其中以胎牛血清质量最好。n优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌 、支原体、病毒污染。n血清的灭活（消除补体活性）：56 ，30 分钟n血清的消毒：过滤除菌n抗菌素的使用：n在培养液配制后，培养液内常加适量抗菌素，以抑制 可能存在的细菌的生长。n通常是青霉素和链霉素联合使用。培养基内青霉素、 链霉素最终使用浓度为每毫升100单位。n庆大霉素：每毫升100单位方便、广谱、稳定完全培养基的组成n基础培养基 80一95n血清 5一20n碳酸氢钠 2.0 g/Ln青、链霉素 各100卑位毫升培养基的配制RPMI-1640培养粉 1袋碳酸氢钠 2.0

11、g青、链霉素 各100单位毫升加三蒸水 至 1000ml, 过滤除菌。调节pH值至7.2加血清（终浓度 10）细胞传代方法n 根据细胞生长的恃点，传代方法有3种。 1.悬浮生长细胞传代n 离心法传代：离心（1000转/分）去上清，沉淀物加新培养液后 再混匀传代。n 直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去除1/2一 2/3，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。 2 半悬浮生长细胞传代（Hela细胞）n此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法 使纫胞从瓶壁脱落下来，进行传代。 3贴壁生长细胞传代n 采用酶消化法传代。常用的消化液有0.25的胰蛋白酶液。贴壁生长细胞传代方

12、法：n1. 吸光培养瓶中的培养液n2.加入1-2 ml 0.25的胰蛋白酶液(以消化液能覆盖整个瓶底为准 ）静置2-10 min（显微镜下动态监测）。n3. 吸去胰蛋白酶液，加入培养液。n4. 用吸管吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，形成细胞悬液。n5. 吸取1/101/40细胞悬液，接种于新的培养瓶内。n6. 加适量新鲜培养液于接种了细胞悬液的新培养瓶内。n7. 将后者放入培养箱中培养。细胞计数n血细胞计数器：手工计数细胞nCoulter计数仪：人工计数培养细胞活力测定n细胞活力测定是肿瘤体外研究中应用最广的技术手段 之一。 n任何培养瓶内生长的细胞都由死细胞和活细胞组成， 从形态上区别死、

13、活细胞是困难的。n1. 细胞克隆形成率实验：单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成的细 胞群体形成肉眼可见的克隆。克隆形成卒用来表示细 胞的增殖能力。 n克隆形成率比克隆形成数接种细胞数n缺点：操作繁琐n优点：精确、可靠n2.台盼蓝法n活细胞不被染色，死细胞染成蓝色，用活细胞占 细胞中的百分比表示细胞恬力 n已淘汰n3. 四唑盐（MTT）比色法 四唑盐（MTT）商品名为噻唑蓝，n四唑盐比色法的原理：活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不溶干 水的蓝紫色产物（formazan)，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这 种功能。二甲亚砜（DMSO）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物 ，溶液颜色深浅与所含的form

14、azan量成正比。再用酶标仪测定OD 值nMTT法简单快速、准确，广泛应用于新药筛选、细胞毒牲试验、 肿瘤放射敏感性实验等。n操作步骤n（1）单细胞悬液接种于96孔培养板；103-104细胞/孔，每孔培养 基总量200微升（96孔培养板每孔容积370微升），37、5nCO2培养箱中培养一段时间（根据实验目的决定培养时间）n（2）加入2毫克毫升的MTT液（50微升孔）；继续培养3小 时。n（3）吸出孔内培养液后，加入DMSO液（150微升孔），将培 养板置于微孔板扳荡器上振荡10分钟，使结晶物溶解。n（4）酶标仪检测各孔OD值（检测波长570纳米）。记录结果， 绘制细胞冻存和复苏n细胞低温冷冻贮

15、存是细胞室的常规工作 。细胞冻存与细胞传代保存相比可以减 少人力、经费，减少污染，减少细胞生 物学特性变化。冻存和复苏的原则：慢冻快融n当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱 水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰 晶。n n 如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生 大的冰晶；相反结晶就大，大结晶会造成细胞膜、 纲胞器的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是防止 小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。慢冻程序n标准程序：n 当温度在-25 以上时， 12 /minn 当温度达-25 以下时， 510 /minn 当温度达-100时，可迅速放入液氮中n 细胞冻存器n简易程序：n 将冷