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1、重组DNA技术及应用Recombinant DNA Technology and its Application许正平 博士浙江大学医学院生物电磁学省重点实验室参 考 书J. 萨姆布鲁克等编，分子克隆实验指南，科学出版社F. 奥斯伯等编，精编分子生物学实验指南，科学出版社INTERNET思 考1、如果已知某基因的一段DNA序列，如何获得（克隆）该基因？2、如果已知某基因的两段DNA序列，如何获得（克隆）该基因？3、已知一蛋白质的部分氨基酸序列，怎样克隆编码该蛋白的基因？4、已分离、纯化某蛋白质，并制备了相应的抗体，如何克隆其编码基因？5、如果已获得某基因的DNA序列，如何研究其结构、功能？1、
2、如果已知某基因的一段DNA序列，如何获得（克隆）该基因？1）获得/人工合成该DNA片段2）标记该DNA片段3）从cDNA/基因组文库筛选阳性克隆4）基因片段的分离、克隆和分析5）基因研究1、如果已知某基因的一段DNA序列，如何获得（克隆）该基因？1）获得/人工合成该DNA片段2）标记该DNA片段3）从cDNA /基因组文库筛选阳性克隆4）基因片段的分离、克隆和分析5）基因研究1、如果已知某基因的一段DNA序列，如何获得（克隆）该基因？1）获得/人工合成该DNA片段2）标记该DNA片段3）从cDNA /基因组文库筛选阳性克隆4）基因片段的分离、克隆和分析5）基因研究1、如果已知某基因的一段DNA
3、序列，如何获得（克隆）该基因？1）获得/人工合成该DNA片段2）标记该DNA片段3）从cDNA文库/基因组筛选阳性克隆4）基因片段的分离、克隆和分析5）基因研究1、如果已知某基因的一段DNA序列，如何获得（克隆）该基因？1）获得/人工合成该DNA片段2）标记该DNA片段3）从cDNA /基因组文库筛选阳性克隆4）基因片段的分离、克隆和分析5）基因研究1、如果已知某基因的一段DNA序列，如何获得（克隆）该基因？1）获得/人工合成该DNA片段2）标记该DNA片段3）从cDNA /基因组文库筛选阳性克隆4）基因片段的分离、克隆和分析5）基因研究2、如果已知某基因的两段DNA序列，如何获得（克隆）该基
4、因？1）人工合成DNA片段（oligonucleotide, oligo）2）PCR扩增该两oligo间的DNA序列3）基因片段的分离、克隆和分析4）基因研究2、如果已知某基因的两段DNA序列，如何获得（克隆）该基因？1）人工合成DNA片段（oligonucleotide, oligo）2）PCR扩增该两oligo间的DNA序列3）基因片段的分离、克隆和分析4）基因研究2、如果已知某基因的两段DNA序列，如何获得（克隆）该基因？1）人工合成DNA片段（oligonucleotide, oligo）2）PCR扩增该两oligo间的DNA序列3）基因片段的分离、克隆和分析4）基因研究2、如果已知某
5、基因的两段DNA序列，如何获得（克隆）该基因？1）人工合成DNA片段（oligonucleotide, oligo）2）PCR扩增该两oligo间的DNA序列3）基因片段的分离、克隆和分析4）基因研究2、如果已知某基因的两段DNA序列，如何获得（克隆）该基因？1）人工合成DNA片段（oligonucleotide, oligo）2）PCR扩增该两oligo间的DNA序列3）基因片段的分离、克隆和分析4）基因研究问：所获得的基因完整吗？ TTTTTT5 5 cap 3 tailOligo 1 Oligo 2如果所克隆的基因不完整，怎么办？5 RACE 3 RACE问：所获得的基因完整吗？ TTT
6、TTT5 5 cap 3 tailOligo 1 Oligo 2如果所克隆的基因不完整，怎么办？5 RACE 3 RACE3、基于氨基酸或全蛋白序列的基因克隆氨基酸序列核苷酸序列合成寡核苷酸筛选cDNA/基因组文库目的基因全蛋白序列抗体筛选表达文库首尾两个核苷酸序列一对合成引物PCR扩增4、如果已获得某基因的DNA序列，如何研究其结构、功能？Possible Research Strategies Knock-out analysis Transgenic study RNA interference (RNAi) Protein expression Structure-function s
7、tudy一、克隆的基本过程Basic Procedures for CloningBasic ProcedureDNA insertVectorConstructCells (bacterium or eukaryotic cell)LigationTransformation/TransfectionIdentification of positive clone pSCS101 带有不可互换成分的复制子的质粒属于不同的不相容组3. 转移性4. 选择标记 选择标记产生的表型可将转化有质粒的细菌轻而易举地挑选出来。抗生素作用机制： 氨苄青霉素与细菌膜上的与细胞壁合成有关的酶类结合并抑制 其活性
8、。而氨苄青霉素抗性基因（Ampr）编码的酶可水解-内酰 胺环，从而解除氨苄青霉素的毒性。 四环素与核糖体30S亚基的一种蛋白质结合，从而抑制核糖体的 转位。而四环素抗性基因（tetr）编码一个膜结合蛋白，可阻止四 环素进入细胞。 氯霉素与核糖体50S亚基结合并抑制蛋白质合成。氯霉素抗性基 因（Cmr 或cat）编码一个四聚体细胞质蛋白，在乙酰辅酶A存在的 条件下，该蛋白催化氯霉素羟乙酰氧基衍生物的形成，使之不能与 核糖体结合而解毒。 卡那霉素和新霉素是一类与核糖体结合并抑制蛋白质合成的脱氧 链霉胺氨基糖苷，可被氨基糖苷磷酸转移酶（APH-II）所灭活。早期: pSC101, ColE1和pCR
9、1 缺点：复制效率低；选择标记不合适；限制性酶切位点少（3500 foundREBASE: http:/ is the key element in playing with DNAFrequency of Restriction Sites in DNA: 4-base cutter: Sau 3A GATC 1/4 x1/4x1/4x1/4 = (1/4)4 = 1/2566-base cutter: BamH IGGATCC (1/4)6 = 1/4096限制性内切酶Restriction Enzyme (RE): 250 commercially available3500 found
10、REBASE: http:/ is the key element in playing with DNAFrequency of Restriction Sites in DNA: 4-base cutter: Sau 3A GATC 1/4 x1/4x1/4x1/4 = (1/4)4 = 1/2566-base cutter: BamH IGGATCC (1/4)6 = 1/4096限制性内切酶(Restriction Endonuclease)II类限制酶一般识别长度为4、5或6个呈二重对称的核苷酸 特异序列GAATTC G AATTCCTTAAG CTTAA G5粘端CTGCAG CT
11、GCA GGACGTC G ACGTC3粘端GGCC GG CCCCGG CC GG平端EcoRIPst IHaeIII同裂酶(Isoschizomer)定义：识别相同序列的限制性内切酶(见BioLabs Catalog)有实用价值的是产生相同粘性末端的限制酶，如：Sau3A I BamH I GATCGGATCC CTAG CCTAGGSauI Xho I GTCGACCTCGAG CAGCTGGAGCTC甲基化作用和甲基化酶II类限制-修饰系统: 限制性内切酶+甲基化酶 是一种保护系统 甲基化酶: dam识别GATC序列, 甲基化Adcm识别CCA/TGG, 甲基化C大肠杆菌M.EcoR
12、I甲基化酶 GAA*TTC CTTA*AG 从而使之不受EcoR I攻击可通过DNA甲基化作用对限制酶切位点进行修饰双酶切(Double Digestion)每中限制酶有它自己最佳的酶切缓冲液对双酶切而言，能使两种酶产生最大酶切效率(75%) 的即为最佳缓冲液。如不能找到这样一种缓冲液，则需做顺序酶切。一般 先用低盐缓冲液，然后调节盐浓度以适合另一种酶的 要求。注意：酶反应体系中甘油的含量须不超过总体积的10%酶切体系一般为20l反应体积，内含： DNA(100ng-1g) 10 x 限制酶切缓冲液 限制酶H2O至终体积为20 l下一步分析 分析型酶切 制备型酶切连接反应体系 Ligation
13、 Reaction一般反应体积为10 l，内含： 载体DNA 插入片段 10 x 连接缓冲液 连接酶 H2O至终体积为10 l连接类型连接酶用量反应温度(oC) 反应时间(hr)平端 4 U 1520 4粘端 1 U RT 148 O.NDNA的分析 (DNA Analysis)1. 琼脂糖凝胶电泳(Agarose Gel Electrophoresis) 2.分离能力: 50bp50 kb3.琼脂糖浓度与凝胶的分离范围4. 琼脂糖浓度(w/v %)线状DNA的有效分离范围(kb)5.0.3560 6.0.6120 7.0.70.810 8.0.90.57 9.1.20.46 10.1.50.
14、23 11.2.00.12 12.3.00.050.5EB染色 SYBR Green I 染色2. 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (Polyacrylamide Gel Electrophoresis, PAGE) 分离能力: 在5500bp间最佳可分开相差1bp的DNA片段聚丙烯酰胺胶浓度与其分离范围的关系丙烯酰胺(w/v %) 有效分离范围(bp) 二甲苯青 溴酚蓝3.510002000460 100 5.0 80500260 65 8.0 60400160 45 12.0 4020070 20 15.0 2515060 15 20.0 610045 12聚丙烯酰胺凝胶类型非变性聚丙烯酰胺凝胶ds DNA变性聚丙烯酰胺凝胶ss DNA 变性剂: 尿素3. UV吸
