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1、第17章 高效液相色谱法 (HPLC)仪器分析教研室陈 稚1HPLC High Performance Liquid Chromatography17.1 概 述17.2 高效液相色谱仪17.3 高效液相色谱的固定相和流动相17.4 高效液相色谱法的主要类型217.1.1 HPLC的发展历史1952 James和Martin发展了气相色谱；1967 Kirkland等研制高效液相色谱法；吸附柱色谱 1906GC 1950年代GC-MS 1950年代末HPLC 1960年代 毛细管电泳和毛细管电动色谱等一系列新的色谱法 1980年代中期3HP1100型 高效液相色谱仪 417.1.2 HPLC
2、与GC的比较 气相色谱（GC）适合分析在操作温度下能气化而不分解的有机化合物 ，仅占15%，衍生后也只有不到20%。 GC不适合高沸点、难挥发及热不稳定化合 物、离子性化合物、高聚物等。5补充 高效液相色谱法保留值塔板数塔板高度分离度选择性气相色谱 液相色谱塔板理论速率方程液相色谱所用基本概念：617.1.2 HPLC 与经典LC的比较7HPLC：高效色谱柱、高压泵、高灵敏检测器 经典LC：粒径150-200m，流速0.x ml/min，分离时间数小时（依重力流动）tS8用高压输液泵将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，经进样阀注入待测样品，由流动
3、相带入柱内，在柱内各成分被分离后，依次进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析的方法称为高效液相色谱法 （high performance liquid chromatography, HPLC)。17.1.3 HPLC 定义917.1.4 现代高效液相色谱法的特点：(1)高效：(2)高压：HPLC工作压力高达20MPa-30MPa。(3)高速：分离一个样品只需几分钟至几十分钟。(4)高灵敏度：紫外检测器的检测限可达109g，荧光检测器的检测限可达1012g 。一般GC的填充色谱柱是 数千塔板米，高效液相色谱法的塔板 数可达约8万塔板/米，使分 离效率大大提高。10高效液相色谱法的优点是：其缺
4、点是：价格昂贵，要用各种填料柱， 容量小，流动相消耗大且有毒性的居多。17.1.5 高效液相色谱法的优、缺点检测的分辨率和灵敏度高， 分析速度快，重复性好，定量精 度高，应用范围广。适用于分析高沸点、大分子 、强极性、具有生物活性、热稳 定性差的化合物。1117.1.6 色谱分离的过程1217.1.6 样品分子在色谱柱中的分离过程1317.1.6 样品分子在色谱柱中的分离过程14色谱分离的实质是样品分子（即溶质）与溶剂（即流动相或洗脱液）以及固定相 分子间的作用，作用力的大小，决定色谱过程的保留行为。17.1.7 色谱分离的实质1517.2 高效液相色谱仪1617.2 高效液相色谱仪结构输液系
5、统进样系统分离系统检测系统1717.2 高效液相色谱仪结构高效液相色谱仪结构示意图输液系统进样系统分离系统检测系统1817.2 高效液相色谱仪结构进样器贮 液 器高压泵色谱柱馏分 收集器检测器记录仪输液系统进样系统分离系统检测系统1917.2 高效液相色谱仪结构进样器贮 液 器高压泵梯度 洗脱装置色谱柱馏分 收集器检测器记录仪高效液相色谱仪结构示意图输液系统进样系统分离系统检测系统2017.2 高效液相色谱仪结构17.2.1 输液系统17.2.2 进样系统17.2.3 分离系统17.2.4 检测系统2117.2 高效液相色谱仪结构17.2.1 输液系统高压输液泵在线脱气装置梯度洗脱装置2217
6、.2.1 高压输液泵作用：将流动相以稳定的流速或压力输 送到 色谱系统。输液泵的稳定性直接关系到分析结果 的重复性和准确性。2317.2.1 高压输液泵性能：足够的输出压力输出恒定的流量输出流动相的流量范围可调节压力平稳,脉动小 2417.2.1 高压输液泵注意事项：防止任何固体颗粒进入泵体流动相不应含有任何腐蚀性物质泵工作时防止溶剂瓶流动相用完不要超过最高压力流动相应先脱气25在线脱气、超声脱气、真空脱气等作用：脱去流动相中的溶解气体。流动相先经过脱气装置再输送到色谱柱。脱气不好时有气泡，导致流动相流速 不稳定，造成基线飘移，噪音增加。 O2, N2, CO217.2.1 在线脱气装置261
7、7.2.1 梯度洗脱装置Isocratic elution 恒定组成的单一溶剂体系Gradient elution 以一定速度改变多种溶剂的 配比淋洗，目的是分离多组 容量因子相差较大的组分。High-Pressure Mixing作用:缩短分析时 间,提高分离度,改 善峰形,提高监测 灵敏度27补充、液相色谱中的柱外谱带展宽色谱柱本身以外区域的谱带展宽，称为柱外谱带展宽。样品注入色谱柱后，在色谱柱以外的任何死空间（如进样器、柱接头、连接管和检测器）中，样品分子的扩散和滞留，都会引起色谱峰的扩展，而使柱效降低，所以柱外死体积影响是不能忽略的。2817.2.2进样系统:密封性好，死体积小，重复性
8、好1 注射器进样装置优点：可以任意改变进样体积，注射快速,不易造成峰扩张。缺点：重现性较差，试液容易渗漏2917.2.2 进样系统2 高压定量进样阀(六通阀)优点：进样量的可变范围大，耐高压，易于自动化缺点：容易造成色谱峰扩张3017.2.2 进样系统31色谱柱色谱柱是实现分离的核心部件。要求柱效 高、柱容量大和性能稳定。柱性能与柱结构 、填料特性、填充质量和使用条件有关。 17.2.3 分离系统： 色谱柱32常用内壁抛光过的不锈钢制成颗粒直径早期大（2075m），柱管径一般 为2mm，柱长为50100cm.近年来，用高效微型填料（310m）管径为 45mm，长为10cm50cm的直形不锈钢柱
9、。 每米柱效可达8万塔板数33spherical and irregular silica particles Macroporous spherical silica particle. K.K.Unger, Porous silica, Elsevier, 1979 基质：载体或担体。数m数十m，球形。硅胶或有机高分子聚合物17.2.3 分离系统： 色谱柱填料34柱性能指标:柱压理论塔板高度H理论塔板数n对称因子f容量因子k选择性因子分离度R3517.2.4 检测系统检测器应具有：溶质性检测器有：紫外、荧光、电化学检测 器等总体检测器有：示差折光、介电常数检测器 等灵敏度高、噪音低、线性
10、范围宽、响应快，死体积小 、定量准确、适应范围广等 特点，同时还应该对温度和 载液流速的变化不敏感。3617.2.4 紫外-可见检测器光源检测室光栅二极管阵列 检测 UV detector cell内容积：1-10 l光路长：2-10mm 3717.2.4 荧光检测器特点： 有非常高的灵敏度和良好的选择性，灵敏度要比紫外检测法高23个数量级，特别适合于药物和生物化学样品的分析。3817.2.4 荧光检测器3917.2.4 质谱检测器HPLC-ESI/MS4017.2.4 数据处理 计算机进行峰面积的积分、分析结果的计算、误差的分析或色谱图的输出，记录的信号进行程序化、自动化处理。41复习: 高
11、效液相色谱仪结构进样器贮 液 器高压泵色谱柱馏分 收集器检测器记录仪输液系统进样系统分离系统检测系统4217.2 Main stages of HPLC analysisPrepare Sampleinject into column elute with mobile phasedetect sample componentsidentify and quantify4317.2 高效液相色谱仪的工作流程进样器贮 液 器高压泵梯度 洗脱装置色谱柱馏分 收集器检测器记录仪高效液相色谱仪结构示意图 4417.2 高效液相色谱仪的工作流程进样器贮 液 器高压泵梯度 洗脱装置色谱柱馏分 收集器检测器
12、记录仪高效液相色谱仪结构示意图 4517.2 高效液相色谱仪的工作流程进样器贮 液 器高压泵梯度 洗脱装置色谱柱馏分 收集器检测器记录仪高效液相色谱仪结构示意图 4617.2 高效液相色谱仪的工作流程进样器贮 液 器高压泵梯度 洗脱装置色谱柱馏分 收集器检测器记录仪高效液相色谱仪结构示意图tS4748高效液相色谱的应用：医药卫生、食品、人体化学成分、各类合成药物成分、各种天然植物和动物药物化学成分。17.3 高效液相色谱法的应用49高效液相色谱的应用：医药卫生、食品、环保 等各个领域最为重要的分离分析技术。17.3 高效液相色谱法的应用有机酸、氨基酸、糖、维生素、脂肪酸、香料、甜味剂、防腐剂、
13、人工色素、病原微生物、霉菌毒素等。50南京市儿童医院，徐进，儿科药学杂，1999年第5卷第2期色谱条件 色谱条件 : 岛津LC10A D高效液相色谱仪； RF一l0AxL荧光检测器，荧光激发波长360nm， 发射波长430nm; LD一I0A泵，分析柱为Spherisorb ODS 5m, 200 x 4. 6mm,预柱为Waters ODS柱，室温; 流动相为0. 05mol/L磷酸盐缓冲液(pH=4. 0 ):乙 睛(78:22 v/v)，内含0. 05mol/L戊磺酸钠， 流速为1 ml/min17.3 HPLC法测定人血浆中氨苄青霉素浓度51样品分离良好，保留 时间为7. 3分钟 52
14、取含有氨苄青霉素的血浆0. 2m1.加人10%三氯醋酸0. 2m1，涡旋振荡混匀，12000r/min离心10min，取上清液0. 2m1于安瓿中，再加人0. 5mol/L盐酸0. 2m1，密封安瓿后置100水浴90min，冷却后再加人蒸馏水0. 2m1,涡旋振荡混匀后，进样20微升测定。以外标法峰面积定量。 血样处理方法53HP1100型高效液相色谱仪色谱柱：Hypersil-ODS2-C18，4.6 mm X 250 mm柱检测波长215nm，进样量20L，流动相为甲醇+0.02mol/L 乙酸铵(35+65)，流量0.50mL/min17.3 HPLC法快速测定食品中糖精钠、苯甲酸、 山
15、梨酸 5455色谱图2: 高良姜色谱图 1 diarylheptanoid A 2 高良姜素 3 diarylheptanoid B56一、液相色谱的速率理论二、影响分离的因素补充 高效液相色谱法57n 为色谱柱的理论塔板数。 因为tR是热力学常数，当色谱柱的长度 一定，理论板数目n越大，色谱峰越窄。一、液相色谱的速率理论58液相色谱的速率方程为：D 为扩散系数，Cd、 C为有关项的板高系数，dp 和 df 为填充粒子直径和固定液膜的厚度一、液相色谱的速率理论59一、液相色谱的速率理论Hd 2p当粒度从45m降至6m时时,板高要降低10倍。60二、影响分离的因素速率方程：H = A + C u
16、故液相色谱H-u曲线与气相色谱的形状不同，如图影响分离的主要因素有流动相的流量、性质和极性。 611. 影响分离的因素流速流速大于0.5 cm/s时, Hu曲线是一段斜率不大的直线。降低流速，柱效提高不是很大。但在实际操作中，流量仍是一个调整分离度和出峰时间的重要可选择参数。622. 固定相及分离柱选择短柱、细内径提高分析速度；研制高效柱填料是一活跃领域。633.流动动相组组成流动相按组成不同可分为单组分和多组分；按极性可分为极性、弱极性、非极性；按使用方式有等度洗脱和梯度洗脱。643.流动动相组组成常用溶剂:己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。654.选择选择 流动动相时应时应 注意的几个问题
