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1、利用荧荧光显显微技术术研究生物单单分子陈浩 200425023 分析化学专业光学单单分子方法的进进展近20 年来, 光学探测方法有了长足的进步。在80 年代出现并逐渐成熟起来 的近场显微术为超衍射极限分辨成像提供了基本手段, 同时也使光学显微 术进入了纳米科学的领域。而共焦显微术不仅突破传统光学的衍射极限, 而且为光学探测引入了第三维空间信息, 使光学探测具有了层析能力, 实现 了真正的空间三维成像。超短脉冲激光技术直接导致了多光子荧光显微术的成功。尤其是飞秒激光 激发的荧光显微术, 对于提取时间分辨的信息是有力的工具。这种荧光单 分子探测及单分子光谱探测与其数据处理方法的组合, 形成了荧光共
2、振能 量转移的探测方法。通过该方法可以获得1.5 纳米 8 纳米的空间分辨率 的构像信息, 达到光学方法上最高的分辨率。以上近场、共焦、荧光显微术和荧光共振能量转移四种基本技术构成了目 前活跃的生物单分子探测的光学平台。Myosin V 的分子结构肌球蛋白是包含18个不同子类的一大类蛋白分子马达， 但构型上都属于二聚体，有两个明显伸出的“头”，用于 附着在肌球蛋白丝上，这里我们干脆称之为“腿”。Myosin V 的两种运动模型(1)在Hand-over- hand模型中，后 腿向前移动了 74nm，而前腿没 有移动。分子本 身移动了37nm， 染料移动了 372xnm，(如果 MyosinV的
3、结构是 不对称的，x为染 料到轴的平均距 离)。 (2)在inchworm模 型中，myosin 分 子的所有部份都向 前移动37nm，并 且有一个头始终 与肌球蛋白丝结 合在一起。单分子荧光技术检测 运动模型 把一个荧 光分子标记 在myosin V 的一条腿 上，再用荧光显微镜来对标记 的荧光分子进 行检测 。据此来研 究myosin V的迈步过程 。 具体检测技术：全内反射荧光显微共聚焦荧光显微远场 和近场光学检测主动或被动发 光的原因是物体受激发之后,内部电偶极跃迁引起电磁场的 辐射,电磁波从物体表面向自由空间传 播。物体表面以外的场分布可以划分为两个区域: 距物体表面仅几个波长内区域
4、,这一区域称为近场区域; 近场区域以外到无穷远 是远场 区。常规激发和收集均处于远场 区域。在远场 区域只存在可以向无穷远传 播的远场 波(也称为辐 射波) 。近场区域光场包括了限于表面仅几个波 长内存在的成分,即近场波(也称为非辐射波) ;又包括远场 波。近场波也 被称为衰逝波,(隐失波) ,其强度随离开表面距离指数衰减,不能在自由空 间存在。近场波体现了光在传播过程中,遇到空间光学性质不连续时 ,光 波的空间瞬态变 化,这种变化很快在空间衰减,它反映了空间光学性质的 不连续 性。全内反射显微光在光密介质中传输, 如果它以大 于临界角的角度入射到另一个折射 率较小的介质上, 光就会发生全反
5、射。实际上, 即使当角度 Hc, 仍然会有一小部分能量以隐失波的 形式穿透到液体介质中, 在“近场” 情况下, 光沿平行界面传播。由全 内反射产生近场激发照明之后, 利 用共焦或宽场去取像, 即构成荧光 标记全内反射荧光显微镜。全内反射显显微术术典型的垂直照明深度100nm。这这么薄的光学层层析层层切片意 味着信噪比比共焦系统统好得多, 细细胞的光损伤损伤 和光漂白也很小。其图图像是通 过过CCD 相机来捕获获的。这这种仪仪器很灵敏或成像速度很快(但很少有CCD 相 机兼有以上两个优优点) ,目前可达到的量子产产率已到 80% , 成像速率 200帧帧/ 秒。共聚焦显微 在光学成像系统中利用两
6、个焦点来生成物体的象。一个 焦点为使用显微镜物镜把入射的激光在物体表面或内部 形成的。这个焦点便是一个象点，也是一个点光源。它 可以是反射的光，也可以是物体受激发发出的荧光。这 一象点再通过另一个物镜成像在针孔孔径上，则生成了 第二个焦点。这两个焦点是共轭的（共焦）。 通过沿x或y方向一点点地生成象点，综合成平面图像， 再调节z方向生成象点，通过计算机合成三维图像。所以共焦显微镜具有对细胞和光漂白区域进行深度三维成 像的能力。 Hand-over-hand VS inchworm纳米精度荧光成像技术FIONA Fluorescence imaging with one-nanometer ac
7、curacy inchworm模型预测每步的长度应该是37nm，分子本身移 动也是37nm；而hand-over-hand模型观测长度应该是分 子本身移动位移的两倍也就是74nm。为了测试这两个 运动模型，科学家开发了一种单荧光分子成像技术来定位 ，误差可以小于1.5nm，并具有0.5秒的时间分辨率。 同 时可以拍摄几分钟的影像来观察。全内反射荧荧光显显微 (TIRF)用来激发多个单个的荧光分子，并使用CCD来拍摄 帧逐帧连续图像（不存在帧间的失效时间）。单纳米精确 荧光成像(FIONA)技术比使用其它方法在常温下对单荧光 分子定位精确度提高了20倍，在成像能力上提高了10倍。Probes:
8、RB or Cy3在myosin V的光链区用一个RB或Cy3荧光分子 来标记。被标记的myosin V分子被加到肌动蛋 白丝，并用TIRF来观察。 荧光图像使用0.5s的 时间来收集。大概每40m*40m的区域内有20 个点可以被观察到。每个FWHM 280nm，大约 每个光斑在每张照片上有5000到10000个光子被 收集到，这使我们能够对中心区进行定位，偏 差小于3nm，比较亮的点，偏差小于1.5nm。 有些染料的闪烁导 致的亮度变化可以被观察到 。如何检测单 分子 生物单分子的尺度在1 纳米10 纳米, 目前荧光标记的 单分子团在100 纳米左右。传统光学方法(远场显 微镜) 达到的最
9、好分辨率是250 纳米, 共焦显微镜的分辨率仅 提高了1. 4倍 2 倍, 荧光显微术可以再提高2 倍 4 倍, 但是仍不能达到单分子级。因此目前利用荧光远场 成像方法所揭示的大部分是荧光团的行为。在分析了大量图像之后，发现大多数光斑都显示单 个的熄灭，表示这是单个的分子。测出的步距只是 单个被标记的myosin分子的。在没有ATP存在时，荧光光 斑不移动。加入300nm ATP之后可识别 到有移动， 且ATP浓度越大，平均移动 率越高。总的说来，我们观 察到49个不同的标记 上BR的 myosin V分子并检测 到总共 552步。我们观 察了三个不同 群体的myosin V分子群，显 示出几
10、种不同的步长，有 74nm的，也是52/23之间变 动的，或者42/33之间变动 的，但没有发现 37nm长的。Myosin V步距的统计检测 了38个myosin V分 子的365步，每一步都是 迈出74nm。其中32个 分子足够亮，可以产生 一个大于10的信噪比SNR ，在总共231步中。 这 些步的柱状图显 示平均 步距为 73.85.3nm(5.3nm为 平均标准偏差)，这与正 态分布有非常好地拟合(r 2=0.994, X2 r=1.67)。 同时也检测 到了6个按 52/23nm交替前进的分 子，和6个按42/33交替 前进的分子。如果是inchworm模型，每一 步的长度应该都是
11、37nm左右 。结论myosin V 的运动是遵循hand-over-hand模型的， 两个头部交替附着在肌球蛋白丝上向前运动。 以上是一个完整的利用单分子荧光技术来检测生物大分子的例子。Animation: Myosin V walking along an actin filament电子扫描成像显微术及各类 非光学的探针扫描成像显微 术均具有比光学显微镜更高 的空间分辨能力。但它们在 不同程度上存在着系统结构 复杂、成像检测环 境要求苛 刻及样品处理繁琐等困难。 而且它们均不能获得样品重 要的光学信息(例如: 光的反 射率、折射率、偏振态及光 谱等信息) , 特别是不能进行 无损伤性生物
12、活体探测, 因 而无法完全取代光学显微成 像的地位。 荧荧光共振能量转转移该技术可以从探测到的荧光强度随时间的变化来获得 分子之间的距离和方位的信息。它的原理如下: 两个被 不同荧光染料标记的分子或细胞的两部分, 当它们相距 在10- 100 埃时, 能量开始从给体荧光团传递 到受体荧 光团, 即产生能量共振现象, 使该受主辐射光子。探测此能量转换的方法可以利用共焦显微术结合全内反 射显微术的方法。展望虽虽然光学方法对对于探测单发测单发 光团团分子是足够够灵敏的, 但它不可 能局部化这这个探测测点小到可以与一个分子尺度相比的程度。为为 了改进进分辨率缩缩小光孔尺寸, 需使本来很弱的光衰减得更弱
13、。最 终终要求在探测测中不仅仅是探测测到单单分子荧荧光团团的存在, 而且要探 测测到单单分子的结结构形状和行为为。解决该问题该问题 的途径之一是使光 学显显微镜镜的荧荧光高灵敏探测测与原子力显显微术术相结结合。还还可以借 助于光钳进钳进 行单单分子操作技术术, 并且合并光谱谱信息的探测测。在增进进我们对们对 生物大分子行为为及其功能关系的理解方面,单单分子 荧荧光探测测和光谱给谱给 人们们以很大的希望。其最大的挑战战是掌握研 究活细细胞中个别别的和稀有的生物过过程。目前的染料荧荧光技术还术还 不能完全应应付这这种挑战战。但是对对于适用于半导导体激光的荧荧光染 料技术术的研制已经经起步 , 发发展其它利用特殊光物理性质质的新荧荧 光探针针也是必要的。Thank you !
