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1、 第十三章 肿瘤相关基因 肿瘤系细胞增殖与分化失常导致恶性生长现象细胞正常生长与增殖由两大类基因调控：癌基因正调节信号：促进细胞生长、增殖， 抑制分化和凋亡。抑癌基因负调节信号：抑制细胞生长、增殖，促进分化和凋亡。两类基因中任一种或共同变化，细胞增殖分化失控而致肿 瘤正常细胞DNA损伤DNA修复体细胞基因突变原癌基 因活化抑癌基 因失活凋亡基 因失调细胞增生细胞死亡肿瘤细胞DNA损伤DNA修复失败增殖自主性和分化失控生存的独立性侵袭生长和转移性表型不稳定性异质性肿瘤细胞的生物学性状：一 癌基因的发现和概念二（一）发现第一节 癌基因与原癌基因现代分子生物学的重大成就之一是发现了原癌基 因（pro
2、to-oncogene）和原癌基因具有转化成致癌 的癌基因（oncogene）的能力。Biship和Harmus因 为在这方面的贡献而获得1989年的诺贝尔奖。 癌基因是首先在逆转录病毒（RNA病毒）中发现的 早在本世纪初，Rockefeller研究所的Rous医 生将鸡肉瘤组织匀浆后的无细胞滤液皮下注射于 正常鸡，发现可以引起肿瘤，可惜当时对病毒还 缺乏认识，直到五十年代才重新发现原来致瘤的 因素是病毒，并以Rous医生的名字命名为罗氏肉 瘤病毒（Rous Sarcoma Virus ,RSV）。1975年， Biship从RSV中分离到第一个病毒癌基因src，该 基因编码分子量为60kDa
3、的蛋白质，以pp60src表 示。 V-onc 的来源:RNA病毒与宿主细胞基因组整合过程二）概念 1、癌基因(oncogene)：存在生物体内当结构异常 或表达异常时，能导致细胞癌变的基因。2.病毒癌基因(v-oncogene):存在肿瘤病毒中（DNA或RNA病毒)能使宿主细 胞产生肿瘤或使培养细胞转化成癌细胞的动物病 毒基因。3.细胞癌基因(c-oncogene):存在于真核生物中（包括人类）能诱发肿瘤的基 因，正常状态下为非活化形式即原癌基因。特点：普遍存在 酵母人进化中高度保守维持正常细胞生长、繁殖激活（数量或结构改变）转变为癌基因4. 原癌基因(proto-oncogene)：细胞癌
4、基因的 非激活状态。病毒癌基因与原癌基因是同源的，为什么有不 同的生物学效应？v-onc与c-onc的比较1. 从结构上看c-onc是间断的2. v-onc有LTR,有很高的转录活性3. 表达的产物有差别4. 病毒癌基因对病毒本身无关紧要，却可使宿 主细胞转化，引起肿瘤，而细胞癌基因对细 胞的生长、分化和功能活动却是至关紧要的 22-1。再从逆转录病毒感染宿主细胞后的复制周期（图22-2）分析。依表达产物分:生长因子类 如 sis生长因子受体类 如 erb非受体酪氨酸蛋白激酶类 如 src丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶类 如raf GTP结合蛋白类（细胞内信号传导体 ） 如 ras核内转录因子 如 m
5、yc二.癌基因的分类和功能Ras蛋白, 小G蛋白, P21:(G蛋白87KD)鸟苷酸交换因子(GEF),正调节因子GTP酶激活蛋白(GAP),负调节因子Ras基因发生点突变后,P21蛋白的GTP活性丧失GRB2:(Grouth factor bound protein 2)一种连接蛋白, 具SH2( 能与酪氨酸磷酸化的肽段结合),SH3(与富含脯氨酸的肽链结合 )结构域SOS(son of sevenless)一种鸟苷酸释放因子,具有核苷酸转移酶 活性GRB2:(Grouth factor bound protein 2)一种连接 蛋白, 具SH2(能与酪氨酸磷酸化的肽段结合 ),SH3(与富
6、含脯氨酸的肽链结合)结构域SOS(son of sevenless)一种鸟苷酸释放因子,具 有核苷酸转移酶活性三、原癌基因的激活机制* 获得启动子与增强子* 原癌基因扩增： 数量或表达活性增强* 点突变：* 染色体异位：原癌基因移至强启动子或增 强子附近C-rasH基因P21ras产物突变后12GGC甘氨酸GTC缬氨酸膀胱癌的癌基因突变点突变获得启动子与增强子:例如逆转录病毒MoSV感染鼠类成纤维细胞后 ，病毒基因组的LTR整合到细胞癌基因 c-mos 邻近处，使c-mos处于LTR的强启动子和增强 子作用之下而被激活，导致成纤维细胞转化 为肉瘤细胞，又如禽类白细胞增生病毒ALV的 E成分整合
7、到鸡细胞基因组c-myc附近。可使c -myc激活。因此在基因治疗中使用逆转录病 毒载体时必需考虑细胞癌基因的插入激活问 题。 原癌基因扩增:C- onc 肿瘤 扩增倍数c-myc 早幼粒白血病细胞系HL60 20肺癌细胞系 5-30 N-myc 原发神经母细胞瘤-级及神经母细胞瘤细胞系5-1000视网膜母细胞瘤 10 -200小细胞肺癌 50 L-myc 小细胞肺癌 10-20 c-myb 急粒AML 5-10结肠癌细胞系 10 c-erbB 类表皮癌细胞系，原发胶质瘤 30 c-K-ras 原发肺癌，结肠癌，膀胱癌，直肠癌 4-20 N-ras 乳癌细胞系 5-10癌基因 染色体定位 异常
8、 人类肿瘤 c-myc 8q24 t(8:14),t(8:22) Burkitt淋巴瘤 bcl-1 11q13 t(11:14) B细胞淋巴瘤 tcl-2 11q13 t(11:14) T细胞淋巴瘤 c-myb 6q22-24 t(6:14) 卵巢癌染色体异位不同的癌基因有不同的激活方式， 一种癌基因也可有几种激活方式。例如c -myc的激活就有基因扩增和基因重排两 种方式，很少见c-myc的突变；而ras的 激活方式则主要是突变，研究发现所有 肿瘤都不止一种癌基因发生改变。细胞 转化实验证明，各种癌基因之间存在协 同作用,肿瘤的发生是多步骤，多因素的 ，不同的癌基因作用于肿瘤发生的不同 阶段
9、。 结肠腺瘤性息肉（APC）基因结肠癌缺失（DCC）基因(一） 概念：一类抑制细胞过度生长、增殖，从而遏制肿瘤形成 ，当缺失或变异抑癌功能丧失导致肿瘤生成的基因。第二节 抑癌基因（cancer suppressive gene)抑癌基因的二次突变学说抑癌基因概念是在研究视网膜母细胞瘤（ Retinoblastoms ,RB）的遗传损害时提出来的。 RB有家族性和散发性两种类型，其发病机制不同 。前者有先天的隐性遗传损害，其种系基因是有 缺陷的，患RB的频率可高达80-90%，且往往是双 侧，散发性RB，两次体细胞突变发生在同一个细 胞，机率很小，患病也是单侧，Kundson早在1971 年就提
10、出RB发病的“两次击中学说”。现代分子 遗传学分析手段的发展充分支持这一学说.1986年 Draper统计，RB携带者发生第二原发癌的机率比 一般人群要高数百倍。（二） 常见抑癌基因1 p53基因1） p53基因 17 p 13 全长 16-20 kb 含11个外显子2） p53基因 表达产物P53蛋白3） P53蛋白抑癌机制* 具转录因子作用,活化p21基因,产生抑制因子p21蛋白,使细胞停滞于G1期* 抑制解链酶活性* 与复制因子共同作用参与DNA修复，起“基因卫士”作用，如修复失败启动程序性死亡（凋亡）诱导细 胞自杀。* p53基因突变后产生突变p53蛋白，可致癌。 2、RB基因：1）、
11、 13q14,200kb,27个外显子2）、产物pRB 105kDa3)、pRB抑癌机制低磷酸化的pRB可阻止细胞从 G1 S,G2 M的过渡， 抑制c-fos,c-myc的表达3、p16基因9p21,30kb,3个外显子P16都是CDK4和CDK6蛋白激酶抑 制因子，参与细胞增殖周期调控第十四章 基因诊断和基因治疗第一节 基因诊断基本概念和流程传统对疾病的诊断主要是以疾病的表型改 变为依据，如患者的症状、血尿各项指标 的变化，或物理检查的异常结果，然而表 型的改变在许多情况下不是特异的，而且 是在疾病发生的一定时间后才出现，因此 常不能及时作出明确的诊断 表型的改变是由基因异常造成的 表型的
12、改变是由基因异常造成的 表型的改变是由基因异常造成的 传统对疾病的诊断主要是以疾病的 表型改变为依据，如患者的症状、 血尿各项指标的变化，或物理检查 的异常结果，然而表型的改变在许 多情况下不是特异的，而且是在疾 病发生的一定时间后才出现，因此 常不能及时作出明确的诊断 (一）概念基因诊断：应用分子生物学技术, 从DNA/RNA水平检测分析致病基因 的存在,变异和表达状态从而对疾 病作出诊断的技术基因的改变是引起疾病的根本原因。 DNA诊断RNA诊断基因诊断是病因的诊断，既特 异又灵敏，可以揭示尚未出现症状 时与疾病相关的基因状态，从而可 以对表型正常的携带者及某种疾病 的易感者作出诊断和预测
13、，特别对 确定有遗传疾病家族史的个体或产 前的胎儿是否携带致病基因的检测 具有指导意义 样品抽提PCR扩增分子杂交杂交信号检测DNARNAcDNA（二）基因诊断的基本流程第二节 基因诊断的基本技术一、核酸分子杂交1、原位杂交细胞/组织固定杂交冲洗 杂交信号检测 分析结果2、斑点杂交3、Southern 印迹（Southern blot)杂交4、Northern 印迹（Northern blot)杂交总RNA/mRNA变性电泳分离转移 杂交放射自显影/化学显色二、PCR技术基本原理DNA复制 三个步骤变性(denaturation) 退火(annealing) 延伸(extension) PCR的原理PCR的扩增产物cycle 12345n长长片段 246810短片段 002822长长短 21222324252n标准的PCR反
