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1、细胞调亡专题讲座生物体内环境的稳定，不但依赖细胞增殖和分化， 也依赖于细胞的凋亡。细胞凋亡（apoptosis）又 称编程性死亡(PCD;Programmed Cell Death)， 是生物界重要的生命现象之一。 细胞凋亡是近年来生物学及医学研究的一个热点。 凋亡不仅是一种特殊的细胞死亡类型 ，它还具有 重要的生物学意义及复杂的分子生物学机制。对凋 亡的研究不仅有助于对疾病过程中细胞死亡及其机 制的深入阐明，而且将导致疾病新疗法的问世。一:概述1:细胞凋亡的研究历史NATURE REVIEWS | MOLECULAR CELL BIOLOGY VOLUME 2 | JULY 2001 | 5
2、45VOGT, C. Untersuchungen uber die Entwicklungsgeschichte der Geburtshelferkroete (Alytes obstetricians). Solothurn, Switzerland: Jent 53:5563J Clin Pathol: Mol Pathol 2000;53:5563J Clin Pathol: Mol Pathol 2000;53:5563J Clin Pathol: Mol Pathol 2000;53:5563（1）钙离子和蛋白激酶改变：细胞内Ca2+的堆积和重新分布，细胞核内Ca2+的增多， 激
3、活核酸内切酶的活性，蛋白激酶C在不同细胞类别和不同周期活性表现不一。 （2）核酸内切酶激活把DNA内切成180碱基对倍数的核苷酸片段，呈梯状电泳现象。 （3）组织谷氨酰胺转移酶的积累并激活。 （4）细胞骨架如肌动蛋白的变化。 （5）细胞表面糖链、植物血凝素与玻连蛋白受体增加，磷脂酰丝氨酸的外露改变细胞表面的生化特性 。生物化学特征NATURE REVIEWS | MOLECULAR CELL BIOLOGY VOLUME 1 | NOVEMBER 2000 | 1253:凋亡的阶段J Clin Pathol: Mol Pathol 2000;53:55 63(1)信号传递包括环境因素和体内因素
4、 通过受体介导 称为死亡受体（death receptors, DR）， 配体（death ligands ） 结合激活死亡蛋白酶系（death caspase） 死亡受体有肿瘤坏死因子受体基因家族，CD95 （Fas或Apol）和DR（或APO）系列 肿瘤坏死因子受体基 因家族，CD95（Fas或Apol）和DR（或APO）。 死亡区域（death domain），参与激发蛋白酶系列和细胞 产生凋亡调节机制。 ( 1 ) 信 号 传 递(2):中央调控线粒体 包括Caspases激活因子的释放，如细胞色素C(cytochrome C,Cyt C)、电子传递链的改变、线粒体膜电位( m)的 丧
5、失、细胞内氧化还原状的改变、Bcl-2家族促进和抑制 凋亡蛋白的参与等。 线粒体膜通透性的改变(permeability transition,PT) 线粒体内膜对细胞质中分子量1 500 kD，如质子、Ca2+ 、谷胱甘肽等通透性突然增加(可以通过OD540的降低或放 射性标记物如蔗糖、Ca2+等检测出来)。PT孔道蛋白具有感 受器的功能。NADH/NAD+、NADPH2/NADP+、pH值、二价阳 离子的浓度、腺苷酸的浓度，这些参数的改变均能引起PT 。细胞色素细胞色素C C在凋亡中作用在凋亡中作用CytCyt C C是一种水溶性蛋白，位于线粒体内外膜之间，并是一种水溶性蛋白，位于线粒体内
6、外膜之间，并 与内膜松弛相连。在胞质核糖体上合成去血红素与内膜松弛相连。在胞质核糖体上合成去血红素CytCyt C C， 经专门途径经专门途径无需信号肽、电化学势和一般的蛋白转运无需信号肽、电化学势和一般的蛋白转运 机制，进入线粒体内外膜之间，在得到一个血红素分子后机制，进入线粒体内外膜之间，在得到一个血红素分子后 ，成为完整的，成为完整的CytCyt C, C,并带上正电荷而不能通过外膜。并带上正电荷而不能通过外膜。 Apaf-1(apoptosis protease-activating factor 1)Apaf-1(apoptosis protease-activating facto
7、r 1)与与 Apaf-2(Apaf-2(即释放到胞质中的即释放到胞质中的CytCyt C) C)及及Apaf-3(Caspase 9)Apaf-3(Caspase 9)结结 合促进合促进Caspase-3Caspase-3激活。激活。 Bcl-2Bcl-2对线粒体功能的调控对线粒体功能的调控 抑制凋亡蛋白：抑制凋亡蛋白：Bcl-2Bcl-2、BclBcl-X-XL L、Mc11Mc11、Bfe1Bfe1、A1A1等和促等和促 凋亡蛋白：凋亡蛋白：BaxBax、BclBcl-X-XS S、BadBad、BakBak、BikBik等，它们分布在等，它们分布在 线粒体外膜、核膜和内质网膜上。线粒体
8、外膜、核膜和内质网膜上。 Bcl-2Bcl-2抑制抑制PTPT的机理是阻止一些小分子如的机理是阻止一些小分子如CaCa2+2+从基质中释放从基质中释放 以及以及AIFAIF从内外膜之间释放到胞质中。从内外膜之间释放到胞质中。 细 胞 色 素 C 在 凋 亡 中 作 用 B c l - 2 对 线 粒 体 功 能 的 调 控（3）细胞结构改变：形态变化：细胞皱缩，核致密，微绒毛消失。 生化特点：多种酶活化及细胞核的改变。 caspases活化的DNA酶（CAD）进入细胞核内使 染色体的DNA断裂引起细胞死亡。CAD的抑制因 子ICAD拮抗CAD。 三：凋亡的分子机制 1：细胞凋亡的触发因子物理因
9、素 ：射线，紫外线，加热等。糖皮质激素；细胞毒药物：放射菌素，氨甲喋呤，顺铂， 阿糖胞苷等。受体：APO-1/FAS抗体的受体，TCR-CD3特异抗体的受体；引起cAMP水平升高的化合物：cAMP及其衍生物，霍乱毒素，茶碱细胞因子TNF-及TGF-等。 细胞凋亡的负性触发因子主要是一些生长因子包括NGF，CSF(G-CSF，GM-CSF)，IL(IL-2 ，IL-3，IL-4，IL-6)等。三 ： 凋 亡 的 分 子 机 制 1 ： 细 胞 凋 亡 的 触 发 因 子2：凋亡基因 Bcl-2(B cell lymphoma/leuklemia-2，B细胞淋巴 瘤/白血病-2)基因家族。 包括抑
10、制细胞凋亡的Bcl-2、Bcl-X2、BHRF1和Bak 及参与细胞存活调节的Mcl-1、A1和LMW5-HL等。 人Bcl-2基因是从与滤泡性淋巴瘤相关的t(1418)染色体易位的断 裂点部位克隆到。Bcl-2从其正常定位(18q-21)移位于14q-32的免 疫球蛋白重链并列的位置。导致在淋巴瘤细胞中该基因的转录激活 以及26kD Bcl-2 蛋白的过度表达。Bcl-2基因及其表达蛋白可抑制 多种组织细胞的凋亡和延长细胞寿命，故将其称为凋亡抑制其因。 Bcl-2蛋日是一种与细胞器特别是线粒体膜关联的稳定蛋白，它主 要位于线粒体外膜、核被膜和内质网膜。高浓度Bcl-2蛋白抑制发 生凋亡细胞内
11、质中钙离子的释放。Bcl-2是通过直接或间接地与细 胞信号传递蛋白(如P53蛋白)作用而调控细胞凋亡。Bcl-2通过抗氧 化作用或抑制氧自由基的产生，抑制细胞凋亡，Bcl-2有44同源并参与调节细胞死亡的蛋白质Bcl-X。Bcl-X分2 种：Bcl-XL，Bcl-XS。 Bcl-XL蛋白可抑制细胞凋亡，其功能相似于Bcl-2蛋白而较弱。 Bcl-Xs的作用与Bcl-2、Bcl-XL相反。 Bcl-Xs可能是作为Bcl-2的结构抑制子，通过对其下游的细胞凋 亡调节子的作用而抑制Bcl-2的功能。Bax蛋白，与Bcl-2有21同源性。Bax蛋白有对抗Bcl-2蛋白抑 制凋亡的作用。Bcl-2/Ba
12、x两蛋白之间的比例是决定对细胞凋亡 抑制作用强弱的关键因素，Bcl-2Bax，细胞趋于存活；Bax Bcl-2，细胞趋于凋亡。因此认为Bax是极重要的促细胞凋亡基因 之一。 Bak是新近发现的基因，对Bcl-2有抑制作用，类似Bak/Bcl-Xs。 Bak蛋白对Bcl-2的抑制作用可能是通过其它蛋白质信号传递途 径中介。Bak蛋白与Bcl-XL或E1B19K蛋白形成异源二聚体。 P53 P53肿瘤抑制基因正常时分为野生型与突变型两种，野生型P53 诱导细胞凋亡，突变型P53抑制细胞凋亡。P53是一种核内的磷 酸蛋白，抑制细胞周期进程。AJP November 2000, Vol. 157, N
13、o. 5GENES promotes apoptosisIGF-BP-3 Inhibits cellular mitogenic response; promotes apoptosisp21WAF1/Cip1 Binds to cyclin-cdk complexes; inhibits cell cycle progressionGADD45 Binds to PCNA; inhibits cell cycle progression; facilitates DNA repairmdm2 Facilitates proteolytic degradation of p53; inhibi
14、ts p53 transcriptional activity; faclitates p53 transport from nucleus to cytoplasmCell, Vol. 108, 153164, January 25, 2002, Copyright .2002 by Cell PressCell, Vol. 108, 153164, January 25, 2002, Copyright .2002 by Cell Press五:凋亡细胞的检测方法1:形态学技术2:琼脂糖电泳技术3:ELISA4:DNA片段原位标记法5: Caspase Activity Western blot6: Cell Membrqne 7:流式细胞仪检测
