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1、淋巴细胞分离实验E玫瑰花环形成实验实验目的 熟悉淋巴细胞和外周血单个核细胞（PBMC ）的分离原理和方法 学习E花环试验的操作方法 观察显微镜下E花环的形态实验原理 淋巴细胞便于在体外对机体免疫细胞进行 鉴定、计数或功能测定；还可以用于E花 环试验、淋巴细胞转化试验及淋巴细胞培 养（需无菌操作）。 淋巴细胞的方便来源是外周血，分离的原 则是收率较高，纯度较好，失活较低。无 论采用哪种方法，应最大可能保持细胞应 有活性。实验原理 人外周血单个核细胞（PBMC）包括淋巴细胞和单核细胞。 单个核细胞的体积、形态和比重与外周血 其他细胞不同。因此利用一种介于1.075- 1.090之间的聚蔗糖-泛影葡
2、胺（Ficoll- Hypaque）分离液作密度梯度离心，离心后 不同比重的血细胞在分离液中呈梯度分布, 从而分离出PBMC。人血液中各种细胞的密度如下：红细胞：1.093 白细胞：1.092 淋巴细胞和单核细胞：1.075-1.090 血小板：1.030-1.035F/H= 1.0770.001肝素抗凝全血+等量Hanks液将F/H管稍倾斜将稀释血液在距分层液界面上1 cm处沿试管壁缓慢加至分层液上 面。应注意保持两界面清晰，勿使血 液混入分层液内。Ficoll/Hypaque (2:1)1500rpm, 20 min 水平离心血小板 用毛细吸管轻轻插入灰白色层，沿管壁轻轻吸出该层的单个核细
3、胞，盛入另一支离心管中。 将所得到的PBMC悬液用5倍体积的Hanks液或RPMI-l640洗涤2次，1500 rpm 5min。实验原理 本实验采用的是密度梯度离心法。该方法 是根据各类血细胞比重的差异（外周血中 各种细胞的密度不同，人红细胞密度为 1.093，粒细胞为1.092，淋巴细胞为 1.0740.001），利用比重介于某两类细 胞之间的细胞分离液对血液离心，使一定 比重的血细胞依相应的密度梯度分布于不 同的独立带，从而达到分离的目的。实验原理 人 T淋巴细胞表面的CD2分子即绵羊红细胞 受体（ER），在一定的实验条件下，可与 绵羊红细胞（SRBC）结合，形成玫瑰花结 ，称为E玫瑰花
4、环试验。 该试验常用于临床检测人外周血T淋巴细胞 的数量和比例，由此可间接反映机体的细 胞免疫功能状况。 实验原理T细胞SRBCE受体 （ CD2)SRBC受体实验器材 注射器、刻度吸管、毛细吸管、玻片、试 管、离心管 肝素、无Ca、Mg的Hanks液、淋巴细胞分离 液、双蒸水、生理盐水、 0.8%戊二醛、瑞 氏染液 家兔红细胞悬液 、豚鼠淋巴细胞、灭活小 牛血清 离心机、水浴箱、显微镜等。实验方案取豚鼠外周血家兔红细胞淋巴细胞分离显微镜下观察+实验步骤淋巴细胞的分离用Hanks液配成 106细胞/0.1ml加等量灭活小牛血清(0.1ml)取0.1ml加入1绵羊红细胞0.1ml混匀，37温箱放
5、置5分钟1000rpm离心5min加1小滴瑞士染色剂，轻轻混匀取1滴于玻片上，加上盖玻片高倍镜下观察玫瑰花环形成细胞置4冰箱5min30-45min结果判断u凡能结合三个以上绵羊红细胞者为 玫瑰花形成阳性细胞。正常人的花环形成率50-70%，大致可 以代表周围血中T细胞的百分数。左:（甲紫染色，800）：可见2个被绵羊红细胞包围而形成玫瑰环的T淋巴细胞； 右:（吖啶橙染色）：图中可见3个染成橙黄色荧光的T淋巴细胞被绵羊红细胞所包围。T淋巴细胞玫瑰花环T淋巴细胞玫瑰花环扫描电镜，6500实验步骤1.取1ml豚鼠肝素抗凝血于试管中，加等量Hanks液稀 释，手动轻轻摇匀； 2.取2ml淋巴细胞分离
6、液加入15 ml离心管中； 3.用毛细吸管吸取抗凝血，将抗凝血全部沿管壁缓慢 加入，注意保持两种液体界面清晰 4.室温下立即置水平式离心机以2000rpm 离心20分钟 ，离心后分为4层。 5.用毛细吸管仔细吸取血浆与分层液界面处单个核细 胞（PBMC）层至一刻度离心管内。 6.加入5倍以上体积的Hanks液洗涤3次，每次以 2000rpm离心10分钟，弃上清，沉淀主要为单个核细 胞） 。实验步骤5.取一定量的兔血于离心管中，用无Ca、Mg的 Hanks液洗涤3次，每次离心1500 rpm5min。将压 积RBC配制成1%红细胞悬液。 6.取0.1ml淋巴细胞悬液，加入等量1RBC悬液和 0.1ml小牛血清混匀，37水浴15min， 500rpm 离心5min，取出.（直接取样，滴加事先滴有美 兰染液的载玻片上，计数早期RE花环） 7.置于4冰箱20min，小心吸去上清，沿管壁加1 2滴0.8%戊二醛，轻轻转动试管小心混匀。 8.置于4冰箱15min，取出涂片，待自然干燥后， 瑞氏染色，镜下观察。 实验结果计数花环个数，结合3个以上的SRBC为一个花 环，计算活性E花环形成率，正常值为50%- 80%。E花环形成率 形成花结的淋巴细胞数/淋巴细胞总数 （形成花结+未形成花结） 100%分析讨论 1.你的实验结果怎样？请加以分析。 2.能否用涂片法来观察RE花环形成情况？ 为什么？
