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1、第四章 抗体工程制药张革 中山大学药学院 微生物与生化制药实验室 （1）抗体的产生MMMMDMDGMDA成熟B细胞祖B细胞 前B细胞（胞浆出现IgM重链）不成熟B细胞Mature B cellsImmature B cellsPre-B cellsPro-B cellsB细胞的发育过程第一节、概述（2）IgG的结构（3）抗原抗体反应以以 ELISA ELISA 侦测侦测特定特定病原体病原体（4）抗体的应用Werstern BlotWerstern Blot 、免疫荧光等 检测检测 特定抗原特定抗原2.2.医医 疗疗以毒素以毒素连结连结抗体抗体 攻攻击击 病病变变細胞細胞3.3.检检 验验1.1
2、.研研 究究（5）抗体制药发展历史 1890年发现白喉抗毒素，建立了血清疗法，开抗体制药之先河(马血清多克隆抗体）。1937年用电泳法将血清分为白蛋白、甲种、乙种 、丙种球蛋白，并证明抗体活性主要存在于丙种 球蛋白组分。1975年首次利用B淋巴细胞杂交瘤技术制备出 McAb. 在临床上主要用于诊断和治疗。1986年第一个治疗用单抗OKT3上市McAb 在免疫导向疗法中存在的问题：A、McAb均是鼠源性抗体，可产生人抗鼠抗体（ HAMA），加速了排斥反应，在人体内的半衰期只有5-6h，难以维持有效药物作用靶组织时间；B、完整的抗体分子的相对分子质量过大，难以穿 透实体肿瘤组织，达不到有效的治疗浓
3、度。需要解决的问题：A、降低McAb的免疫源性；B、降低McAb的相对分子质量。解决问题的方法或途径基因工程技术1984年报道了人鼠嵌合抗体，之后制备出了改型抗体、单链抗体、单域抗体、最小识 别单位等多种类型，基本上消除了抗体的鼠 源性（免疫源性），相对分子质量只有完整 抗体分子的1/80-1/3。基因工程包括以下内容基因克隆技术将全套抗体链和链区基因 克隆出来，进行原核表达，筛选特异性的基因噬菌体抗体库技术含人免疫球蛋白的转基因小鼠治疗用抗体发展的三个阶段单克隆抗体基因工程抗体多克隆抗血清第一代抗体第二代抗体第三代抗体整体水平抗体生成技术细胞工程抗体生成技术基因工程抗体生成技术多克隆抗体（抗
4、血清）单克隆抗体嵌合抗体、改形抗体“小型化抗体”（单链抗体）组合抗体库技术噬菌体抗体库技术Ig基因转基因小鼠抗体真核表达技术（6）抗体制药的现状1986年，美FDA批准上市了第一个用于治疗移植物抗宿 主病（GVHD）抗体药物 Orthoclone OKT3，翻开了生 物医药历史崭新的一页 8年后，FDA批准了第二个抗体药物上市。21世纪后，抗 体药物研发上市速度加快，目前共有150余个抗体药物 正在临床评估中，其中20多个已经上市，超过500种处 于临床前研究阶段。1996年开始进入快速发展的轨道。 2002年治疗类风湿关节炎的完全人源化单抗humira批准 上市，这是抗体药物发展具有里程碑意
5、义大事。抗体药物销售趋势图2009年销售400亿，复合增长率高达55% 目前是抗体药物的黄金期 ， 增长势头还在持续,市场远未饱和 至2010年底，全世界共有34个治疗用抗体药物批准上市。2004年，约占全球药物市场份额的22006年，单抗药物的联合销售额为200亿美元。2008年，全球单抗药物市场规模达370亿美元 2009年，单抗药物的联合销售额为400亿美元。2010年，全球单抗药物市场规模达480亿美元 (诊断和研究试剂的单抗药物100亿美元销售额 )2006-2012年间的年销售额增长率为14%。而同一时期，小 分子药物增长率预计仅为0.6%。单克隆抗体药成为增长最 快的药物现在有5
6、大单抗药物占据了80%的市场份额，1.Remicade(类克,强生公司)2.Avastin安维汀、3.Rituxan美罗华 ( Roche和 Geneteck) 4.Humira(修美乐,雅培公司)5.Herceptin (赫赛汀, Roche和Geneteck)抗体药物的价格昂贵，治疗乳腺癌的Herceptin，250mg 支(15000元支，一个疗程8支)，治疗淋巴瘤的Rituxan，400mg支(21000元支，一个疗程支)全世界正在研制的生物技术药品，25%为各类单克隆抗体。前三大生物治疗药物分别为单克隆抗体、疫 苗和肿瘤坏死因子（TNF）抑制剂. 抗体市场快速增长的主要推动：一、销售
7、持续攀升；二、新品种不断上市；三、研发方面的重金投入 。大型医药公司还会通过收购来获得对抗体新药的控 制权。如最近美国强生公司收购了抗体药物研发的 领头羊Centocor公司。2016年，美国FDA批准了22个新药，其中抗体药占七席，31.82%比重。 美国Elusys Therapeutics公司的抗吸入性炭疽感染的Anthim（Obiltoxaximab）； 美国礼来公司的抗中重度银屑病药物Taltz（Ixekizumab）； 以色列梯瓦公司的血液嗜酸性粒细胞水平升高重度哮喘成人患者用药Cinqair（Reslizumab）； 瑞士罗氏公司的抗膀胱癌治疗药物Tecentriq（Atezol
8、izumab）， 瑞士罗氏和Biogen的复发缓解型多发性硬化症药物Zinbryta（Daclizumab）； 美国礼来的抗软组织肉瘤药物Lartruvo（Olaratumab）； 美国默沙东的降低梭菌毒素B感染风险药物Zinplava（Bezlotoxumab）。 （6）抗体制药国内市场1.利妥昔单抗销售额领先 TOP5品种依次是利妥昔单抗、曲妥珠单抗、贝伐珠单抗、雷珠单抗和重组人型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白，TOP5品种用药金额约占据抗体市场的近四分之三。 2.广州地区销量最大 广州是最大的抗体药物市场，占有总市场份额的30 ，其次是北京和上海。3.罗氏产品占绝对优势l上海罗氏制药操控
9、着整个国内抗体药物市场。巴 利昔单抗是北京诺华的独家产品（6）抗体制药国内生产研究现状CFDA到2015年底共批准了10个抗体药物上市，国内形成了三个抗体药物的中试及产业化基地。产业化基 地：北京基地（百泰生物药业）；上海基地（中信国健药 业）；中试：第四军医大学和成都华神集团合作形成西安 基地。 泰欣生(尼妥珠单抗,Nimotuzumab，百泰药业)： 重组人源化抗人表皮因子受体(EGFR)单克隆抗体 注射液，2008年6月上市，人源化程度95%，是世 界上第三个用于治疗实体瘤的单克隆抗体。目前定价:50mg/10ml（3680元） 泰欣生上市不仅代表我国在单抗药物人源化技术 领域取得了重大
10、突破,更重要的意义在于突破了哺 乳动物细胞规模化培养这一生物技术瓶颈 碘131I美妥昔单抗注射液（ 西安基地）131I人鼠嵌合型肿瘤细胞核 单抗注射液（上海基地）注射用重组人型肿瘤坏死因子 受体-抗体融合蛋白”（商品名为“ 益赛普”）（上海基地）抗体制药的国内状态随着生物单抗专利到期，国内已进行了仿制生物 制品的研究开发。据CFDA最新数据，国内有多家获得临床批文。l利妥昔单抗2016年已由正大天晴药业获得临床批文（利妥 昔单抗CXSL1500056苏）l华兰的重组CD20单抗 (利妥昔单抗) 获得临床批文（ CXSL1400096豫）l曲妥珠单抗2016年国内已有两家企业获得临床批文，分别
11、是正大天晴的注射用曲妥珠CXSL1400013苏），华兰的 重组抗人表皮生长因子受体2(HER2)单抗(曲妥珠单抗) 注 射用药（CXSL1400077豫）。 瓶颈：大规模动物细胞培养工艺，而此类工艺属 于欧美严禁出口的技术，长期以来对我国实行封锁 。 成都基地（1）概念抗原决定族 （Epitope, Antigenic determinant） 一个抗原分子上可能有数个抗原决定基 每个 抗原决定族 至少诱生一种专一性抗体 蛋白质性质 抗原决定基 含有六个以上氨基酸第二节、单克隆抗体及其制备多价抗原单克隆 （致敏的B细胞）单克隆抗体单克隆抗体 基本原理 细胞工程抗体-杂交瘤-单克隆抗体（2）多
12、克隆抗体 (Polyclonal antibody)（21）概念给动物接种抗原所获得的免疫血清或抗血清是多种抗体的混合物, 它是由多种抗 原决定簇刺激多株B细胞增殖分化所产生的, 称为多克隆抗体.（22 ）实验室制备多克隆抗体 研究、诊断用所用动物：1 Balb/c小鼠，68周龄；雄性2 大鼠3 兔子生后约12周。抗原：1 纯化的抗原（线性抗原或构型抗原）2 非纯化抗原技术关键：抗原制备应用：免疫学检测抗血清抗 原免 疫所有抗体混合123412341 234B 細胞（23）制备多克隆抗体药物 紧急被动免疫和及紧急预防1234马血清抗原（破伤风毒素）破伤风抗毒素血清 一头成年马反复采血可获得10
13、000 ml以上的抗血清 类毒素毒素马血清抗毒素超敏反应抗体抗原马血清抗毒素的两重性：(1) 特异性抗体-中和毒素(2) 异种抗原，可刺激机体产生抗马血清抗体马血清具有立即提供保护的优势，但异种gamma-球蛋白只是短期有效，常常导致病理合并症（血 清病）和过敏反应。人源多克隆抗体血液制品人的gamma-球蛋白是最理想的(同源性免疫球蛋白) ，但具有传播肝炎和爱滋病的风险。献血员免疫（白喉毒素、狂犬病疫苗等）少量采血测效价大量采血制备抗体 是（3）单克隆抗体 (Monoclonal antibody, McAb)（31）概念:通过B细胞杂交瘤技术, 获得特异性针对某一种抗原决定簇的细胞克隆，产
14、生均一性的抗体.特点:单一特异;可重复;大量供应不需纯抗原;灵敏度高 骨髓瘤细胞致敏的B淋巴细胞杂交瘤HAT: 次黄嘌呤(H),氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶核苷(T) HGPRT：次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转化酶(3-2)、抗原与动物免疫抗原：颗粒性抗原和可溶性抗原p不需纯化; 化学合成或者提纯p微生物或细胞可直接作为抗原免疫动物：BALB/c小鼠和Lou大鼠Balb/c小鼠，8-12周龄；雄性动物与骨髓瘤同品系P183页佐剂:弗氏完全佐剂与弗氏不完全佐剂免疫方法：p体内免疫:免疫原性强,抗原量多.皮下注射,腹腔注射免疫p体外免疫:不能用体内免疫的杂交瘤细胞株不稳定 初步免疫和加强免疫测定抗体效价处死
15、小鼠,去脾细胞 基本方法：取适量脾细胞与骨髓瘤细胞进行混 合，在PEG作用下诱导它们融合，然后用培养液 将PEG融合液缓慢稀释 。 其他融合方法:电融合等 细胞：骨髓瘤细胞（次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核苷 转移酶 (HGPRT)缺陷型）应和免疫动物属于同 一品系，这样杂交率高。（33）免疫及细胞融合饲养细胞：在组织培养中，单个或少数分 散的细胞不易生长繁殖，若加入其他活细 胞则可促进这些细胞生长繁殖，所加入的 细胞称饲养细胞。常用的有小鼠腹腔巨噬 细胞、小鼠脾脏细胞或胸腺细胞。用于细胞融和的骨髓瘤细胞应具备融和率 高，自身不分泌抗体，所产生的杂交瘤细 胞分泌抗体的能力强且长期稳定等特点癌细胞可培养生长
16、浆细胞 B cell 可分泌抗体融合瘤 HybridomaYYYYY YYYYYYYYYYYYY细 胞 融 合两组染色体混在一起也可以培养生长 产生专一性抗体一个 B cell 只 产生一种抗体1234mmmm1 23 41234单抗细胞融合取出脾細胞+ 癌細胞各抗体分开细胞融合后存在脾细胞骨髓瘤细胞杂交瘤细胞HAT培养液：次黄嘌呤（H)、氨基蝶呤（A）、胸腺 嘧啶（T)，氨基蝶呤可阻断DNA的合成。胸腺嘧啶激酶（TK）、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT）。如细胞含有此两种酶则可启动补救 （应急）途径。次黄嘌呤,胸腺嘧啶在次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移 酶作用下合成DNA的合成，并可克服氨基蝶呤的阻断 （34）筛选及抗体检测在HAT培养液中，骨髓
