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1、综合化学实验配位化学和生物无机化学部分切割DNA的金属配合物指导教师：毛宗万 黄华珍 中山大学化学与化学工程学院 2009年10月实验3 功能型甘氨酸铜配合物的合成和表征 模板合成 IR光谱表征 自由基的UV光谱检测实验4 功能型甘氨酸铜配合物对质粒DNA的切割 琼脂糖凝胶电泳 凝胶成像总学时：15 学时 地点：丰盛堂218室实验内容 超螺旋DNA 缺刻型DNA 线型DNA自由基机理自由基进攻糖环或碱基， 导致氧化破坏酯水解机理亲核试剂进攻磷原子，发 生亲核取代反应酯水解机理优于自由基机理DNA结构及其断裂方式l配合物与未受损的DNA表面结合并诱导其断裂l进一步在新的断裂处结合l断裂反应l互
2、补链的断裂DNA的自由基断裂实验背景模拟博莱霉素在天然物质中，由5 个氨基酸、2 个六碳糖和1 个氨基 侧链构成的博来霉素（bleomycin）可导致DNA链的断裂,从 而作为一族广谱抗菌抗肿瘤药物。导致DNA链的 断裂原因是由于博 来霉素分子的一部 分是铁或铜的配合 物，这类配合物能 够产生导致DNA链 断裂的自由基。CuP-3A的配位结构示意图博莱霉素的活性中心Pamatong, F. V.; Detmer. C. A., III; Bocarsly, J. R.; J. Am. Chem. Soc., 1996, 118, 5339. Detmer. C. A., III; Pamato
3、ng, F. V.; Bocarsly, J. R.; Inorg. Chem., 1996, 21, 6292.博莱霉素的模型化合物Cu2+ + e- = Cu+ Cu+ + H2O2 = Cu2+ + OH- + OH氨基酸铜化合物的合成路线模板反应的化学机理化合物1的红外光谱(COO-)(COO-)(NO2 )(NO2 )化合物2的红外光谱(COO-)(COO-)(NH2)氢氧自由基的形成和UV光谱检测由于罗丹明B可与HO迅速反应，并在553nm有强 吸收，因此我们可以利用此反应采用分光光度法检 验HO的生成。 琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳是一种非常简便、快速、最常用的分离 纯化和鉴定
4、核酸的方法 琼脂糖是从海藻中提取的一种线状高聚物 根据琼溶解温度，把琼脂糖分为一般琼脂糖和低熔点琼 脂糖 低熔点琼脂糖熔点为6265，溶解后在37下维持液 体状态约数小时，主要用于DNA片段的回收，质粒与外源 性DNA的快速连接等凝胶浓度选择琼脂糖凝胶的浓度与DNA分离范围琼琼脂糖浓浓度(%)线线型DNA分子的分离范围围(Kb)0.35600.61200.70.8100.90.571.20.961.50.2312.00.12电泳缓冲液 常用三种缓冲液 Tris-硼酸(TBE)、Tris-乙酸(TAE)、Tris-磷酸 (TPE) TBE与TPE：缓冲容量高，DNA分离效果好，但TPE在 DNA
5、片段回收时含磷酸盐浓度高，容易使DNA沉淀 TAE：缓冲容量低，但价格较便宜，因而推荐选用TAE 。缓冲液中的 EDTA 可螯合二价阳离子，从而抑制DNA酶 的活性，防止PCR扩增产物降解核酸电泳的指示剂 指示剂：溴酚兰、二甲苯青 溴酚兰：在碱性液体中呈紫兰色，电泳中，溴酚兰的迁移 率与双链线性DNA片段 二甲苯青：水溶液呈兰色，电泳时，其迁移速率与双链线 性DNA大致相当琼琼脂糖凝胶浓浓度0.6%1%1.4%2%迁移率1Kb0.6Kb0.2Kb0.15Kb琼琼脂糖凝胶浓浓度1%1.4%迁移率2Kb1.6Kb核酸电泳的染色剂溴化乙锭一种荧光染料，EB分子可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发
6、 下，发出红色荧光可在凝胶电泳液中加入终浓度为 0.5ug/ml的EB，有时亦可在电泳后， 将凝胶浸入该浓度的溶液中染色10 15min琼脂糖凝胶EB染色，肉眼可见核 酸电泳带，其DNA量一般5ng溴化乙锭太多，凝胶染色过深， 核酸电泳带看不清时，可将凝胶放入 蒸馏水浸泡30min后再观察ethidium bromide，EB电泳实验装置 电泳仪（普通） 电泳槽（水平平板） 灌胶模具等电泳实验方法 洗净电泳槽，架好梳子 配制琼脂糖凝胶及倒胶 上样与通电 结果观察配制琼脂糖凝胶及倒胶 0.5TBE电泳缓冲液100ml于三角烧瓶中，称取一定量的琼脂糖粉放入后沸水锅或微波炉内加热熔化 ，冷却至60(
7、需要时可加入EB)，倒入电泳槽中，待凝固。 向电泳槽中倒入0.5 TBE，其量以没过胶面2mm为宜，小心移去梳子（如样品孔内有气泡，应除去 ）上样与通电 在DNA样品中加入0.2体积的载样缓冲液，混匀后，加入样品孔内 接通电源，一般红色为正极黑色为负极，切记DNA样品由 负极往正极泳动（靠近加样孔的一端为负），电压为1 5V/cm（长度以两个电极之间的距离计算） 根据指示剂泳动的位置，判断是否终止电泳。一般 电泳条 件为：电压 90V，时间 40min。结果观察和记录 紫外仪上观察电泳带及其位置 拍照 进一步使用软件对光密度进行分析DNA断裂的凝胶电泳图 超螺旋DNA 缺刻型DNA 线型DNA
8、合成实验要点 检查回流装置是否保持干燥 硝酸铜在称量前用滤纸吸干固体表面潮解的溶液 合成实验中前半个小时注意观察反应混合物的颜色变化， 亮蓝色或紫蓝色为反应正常 实验中化合物合成与DNA断裂实验需交叉进行， DNA断裂所需的配合物由准备室提供 若硝基还原使用了较多溶剂，需使用旋转蒸发器除去多余 溶剂 凝胶电泳照相需戴手套l模板合成大环化合物的合成方法（218室）l旋转蒸发器除去多余溶剂（218室）l红外光谱化合物结构表征 （201室）l紫外可见光谱跟踪罗丹明B与氢氧自由基的 反应（204室）l凝胶电泳切割DNA （210室）l凝胶成像分析检测DNA断裂状况（210室）实验技术和方法实验要求 写
9、好预习报告（查阅药品及溶剂的性质、羧基和硝基的IR特征峰值、光谱技术原理及思考题预习等） 实验中做好实验记录及相关计算（包括实验现象、产品重 量、产率等） 做好每一次测试，并打印结果 实验结束时提交最终产品和测试图谱供检查 对实验结果作简要讨论 下一次实验提交本次实验报告 遵守实验规则，严禁违规操作，做好清洁值日（配位化学、生物无机化学、生物技术）l V. V. Gerbeleu, V. B. Arion, J. Burgess, “Template synthesis of macrocyclic compounds”, WILEY-VCH verlag GmbH, 1999.l 计亮年，黄锦汪、莫庭焕等编著，生物无机化学（第二版），中山大学出版社，2001。l 杨频，高飞编著，生物无机化学，科学出版社，2002。l F.奥斯伯， R.布伦特， R.E.金斯顿 等， 精编分子生物学实验指南，1998年6月第1版。参考书
