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1、沉淀分离技术第三章n沉淀和结晶的区别:形态成分纯度n 结晶:同类分子或离子以规则排列形式析出；n 沉淀:无序析出，纯度远低于结晶。n操作方式可分连续法或间歇法两种，规模较小时， 常采用间歇法。n生物分子在水中形成稳定的溶液是有条件的， 这些就是溶液的各种理化参数。n任何能够影响这些条件的因素都会破坏溶液的 稳定性。n沉淀法就是采用适当的措施改变溶液的理化参 数，控制溶液的各种成分的溶解度，从而将溶 液中的欲提取的成分和其它成分分开的技术。n沉淀法操作步骤 ：加入沉淀剂。沉淀剂的陈化，促进粒子生长；离心或过滤，收集沉淀物。n加沉淀剂的方式和陈化条件对产物的纯度 、收率和沉淀物的形状都有很大影响。
2、 沉淀能否发生； 沉淀剂或沉淀条件下对活性结构是否有破坏作用； 沉淀剂是否容易除去； 用于食品、医药产品的沉淀剂是否对人体有害。 沉淀过程应考虑的问题：n 沉淀技术分离生化产物的典型例子是蛋白质的分离提 取 优点：设备简单、成本低、原材料易得、便于小批量生产； 缺点：所得沉淀物可能聚集有多种物质，或含有大量的盐类，或包裹着溶剂，产品纯度常比结晶法低，过滤也较困难。eg. 从血浆中通过5步沉淀生产纯度高达99%的免疫球蛋白 和96%99%的白蛋白。图1 利用蛋白质沉淀大规模提纯白蛋白与免疫球蛋白的工艺流程图n 沉淀法分离蛋白质的特点：u 生产前期可使原料液体体积很快减小1050倍，从而简化生产工
3、艺、降低生产费用；u 使中间产物保持在一个中性温和的环境；u 可及早将目标蛋白从其与蛋白水解酶混合液中分离出来，避免蛋白质的降解，提高产物稳定性；u 用蛋白质沉淀法作为色谱分离的前处理技术，可使色谱分离使用的限制因素降低到最少。3.2 蛋白质的溶解特性n蛋白质的溶解行为是一个独特的性质，由其组 成、构象以及分子周围的环境所决定。n蛋白质在自然环境中通常是可溶的，所以其大 部分是亲水的，但其内部大部分是疏水的。n一般而言，小分子蛋白质比起在化学上类似的 大分子蛋白质更易溶解。图2 蛋白质分子表面的憎水区域和荷电区域蛋白质质性质质溶液性质质分子大小溶剂剂可利用度（如：水）氨基酸组组成 pH值值氨基
4、酸序列离子强度可离子化的残基数温度极性/非极性残基比率极性/非极性残基分布氨基酸残基的化学性质质蛋白质结质结 构蛋白质电质电 性化学键键性质质表1 影响蛋白质溶解度的参数3.3 蛋白质胶体溶液的稳定性防止蛋白质凝聚沉淀的屏障：蛋白质周围的水化层（hydration shell) 可以使蛋白质形成稳定的胶体溶液。蛋白质分子间静电排斥作用。（存在双电 层）因此，可通过降低蛋白质周围的水化层和 双电层厚度（电位）降低蛋白质溶液的 稳定性，实现蛋白质的沉淀。吸引力n颗粒间的相互作用n颗粒间的相互作用的位能取决于离子强度。nVan der Waals 力nKeeson 引力（偶极力）nDebye 引力
5、（诱导力）nLondon 引力 （色散力）是最重要的一种引力，因为所有 分子都是可以被极化的，所以它是普遍存在的。其他沉淀法金属沉淀法聚电解质沉淀法非离子型聚合物沉淀法3.4 蛋白质沉淀方法有机溶剂沉淀法等电点沉淀法中性盐盐析法成本低，不需要特别昂贵的设备成本低，不需要特别昂贵的设备操作简单、安全操作简单、安全对许多生物活性物质具有稳定作用对许多生物活性物质具有稳定作用一、中性盐沉淀法（盐析法）盐析：在溶液中加入中性盐使生物大分子沉淀析出的过程盐析：在溶液中加入中性盐使生物大分子沉淀析出的过程 。得到的样品欲继续纯化，需花一定时间脱盐。得到的样品欲继续纯化，需花一定时间脱盐。优点优点缺点缺点
6、盐浓度Salting-in溶解度Salting-out蛋白质和酶均易溶于水，分子中的COOH、NH2和OH等亲水基团，与极性水分子相互作用形成水化层，包围于蛋白质分子周围形成亲水胶体亲水胶体，削弱了蛋白质分子之间的作用力，蛋白质分子表面极性基团越多，水化层越厚，蛋白质分子与溶剂分子之间的亲和力越大，因而溶解度也越大。 1、中性盐沉淀蛋白质的基本原理亲水胶体在水中的稳定因素 电电 荷荷 水化膜水化膜 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +等点电时的蛋白质 （亲水胶体）带负电荷蛋白质 （亲水胶体）脱水脱水脱水带负电荷蛋白质 （疏水胶体）不稳定蛋白颗粒阴离
7、子阳离子碱酸酸蛋白质聚集沉淀带正电荷蛋白质（ 亲水胶体）碱+ + +水化膜带正电荷蛋白质 （疏水胶体）由于中性盐的亲水性大于蛋白质 和酶分子的亲水性，所以加入大 量中性盐后，夺走了水分子，破 坏了水化膜，暴露出疏水区域。同时又中和了电荷，破坏了亲水 胶体，蛋白质分子即形成沉淀。选用盐析用盐的几点考虑：n盐析作用要强n盐析用盐需有较大的溶解度n盐析用盐必须是惰性的n来源丰富、经济2、中性盐的选择阴离子：柠檬酸根-3酒石酸根-3 F-I03-H2P04-S04-CH3C00- Cl-Cl03-Br-N03-Cl04-I-CNS-阳离子：Th4+Al3+H+Ba2+Sr2+Ca2+Cs+Rb+NH4
8、+K+Na+Li+Hofmeister对一系列离子沉淀蛋白质的能力进行排序，称Hofmeister序列，或感胶离子序。常用于蛋白质沉淀的盐为硫酸铵和硫酸钠。硫酸钠虽无腐蚀性但低于400C就不易溶解，因此只适用于热稳定性较好的蛋白质的沉淀过程。02080100 （NH4)2SO470.675.495.3103Na2SO44.918.943.342.2NaH2PO41.67.893.8101（1）溶解度大（2）分离效果好（3）不易引起变性，有稳定酶与蛋白质结构的作用。（4）价格便宜，废液不污染环境。最常用的盐：硫酸铵缓冲能力弱，具腐蚀性，含N缺点缺点优优 点点（1）加入固体盐法3、 盐析的操作方法
9、适用：饱和度高，不增大溶液体积加入硫酸铵固体的量：查表、计算查表时查表时 注意温注意温 度度饱和度：在给定条件下以可能达到的最大浓度的百分数表示的盐浓度。（1）加入固体盐法2025g ：加入固体硫酸铵的质量 S2：所需达到的硫酸铵饱和度 S1：原溶液的硫酸铵饱和度 （2 2）加入饱和溶液法）加入饱和溶液法 适用：蛋白质溶液体 积不大，所需调整的 硫酸铵浓度不高。 V：所需加进的饱和硫酸铵溶液的体积； V0：原溶液体积； S2：所需达到的硫酸铵饱和度； S1：原溶液的硫酸铵饱和度。 饱和硫酸铵的配制方法在一定量的水中加入过量的硫酸铵，加热至5060，趁热滤去沉淀，再在0或室温平衡12天，有固体析
10、出时达100饱和度。 优点硫酸铵浓度变化连续，盐析效果较好 。缺点硫酸铵饱和度的测定、计算工作手续 繁琐，而且透析袋 容积有限、盐析速 度慢、硫酸铵耗费 大。 （3）透析平衡法 方法一：取料液分成等体积几份，冷却至04、盐析曲线的制作 各级均离心分离沉淀物，将沉淀溶于2倍体积的缓冲液中，测 定其中总蛋白和目标蛋白浓度（或测定离心上清液）以饱和度为横坐标，沉淀（或上清液）中总蛋白和目标蛋白浓 度为纵坐标，得到蛋白质溶解度曲线 蛋白质量(mg)或酶 活力硫酸铵饱和度蛋白质量(mg)或酶 活力硫酸铵饱和度方法二各级均离心分离沉淀物，将沉淀溶于2倍体积的缓冲液中，测 定其中总蛋白和目标蛋白浓度以饱和度
11、为横坐标，总蛋白和目标蛋白浓度为纵坐标，得到蛋 白质溶解度曲线 蛋白质量(mg)或酶 活力硫酸铵饱和度蛋白质量(mg)或酶 活力硫酸铵饱和度5、盐析的影响因素 （1） 离 子 强 度 与 离 子 类 型S：离子强度为I时蛋白质的溶解度； S0：离子强度为0时蛋白质的溶解度； KS：盐析常数。 盐析时，蛋白质溶解度与中性盐的离子强度的关系： 当溶剂的温度一定时，对 于某一溶质，S0是一常数 （溶解度常数） KS越大，有效成分溶解度随盐浓度增加而减小的程度越大。 KS越大，分级范围越小，盐析效果越好。多价阴离子具有很高的KS，但高价阳离子的存在反而降低KS ； 大而不规则的蛋白分子KS越大。KS主
12、要取决于盐的性质：离子价数离子半径介电常数KS几种盐的盐析能力的排列次序：磷酸钾硫酸钠磷酸铵柠檬酸钠硫酸镁1纤维蛋白 2血红蛋白 3拟球蛋白 4血清蛋白 5肌红蛋白几种蛋白盐析时离子强度与溶解度的关系图 KS分段盐析法分段盐析法在一定pH、温度条件下，改变离子强度。 适用于早期粗提阶段的分步分离。在一定离子强度下，改变pH、温度。适 于后期分离纯化和精制。（2） 蛋 白 质 浓 度硫酸铵盐析法测定羧基肌红蛋白：蛋白质浓质浓 度g/L硫酸铵饱铵饱 和度%结结果3058开始沉淀366开始沉淀306590%沉淀析出 当蛋白浓度增加10倍时，盐析时 所需硫酸铵的饱和度约减小7%。 适宜蛋白质浓度是2.
13、53.0（25 mg/mL30mg/mL ） （3） pH 的 影 响蛋白质所带净电荷越多，它的溶解度就越大。改变pH值可改变蛋白质的带电性质，因而就改变了蛋白质的溶解度。远离等电点处溶解度大，在等电点处溶解度小，因此用中性盐沉淀蛋白质时，pH值常选在该蛋白质的等电点附近。 在水或稀盐溶液中测得的等电点 与在高盐溶液中测得的等电点结果可 能不一样 注意注意（4 ） 温 度 的 影 响温度是影响溶解度的重要因素，对于多数无机盐和小分子有机物，温度升高溶解度加大。但对于蛋白质、酶和多肽等生物大分子，在高离子强度溶液中，温度升高，它们的溶解度反而减小。在低离子强度溶液或纯水中蛋白质的溶解度大多数还是
14、随温度升高而增加的。在一般情况下，对蛋白质盐析的温度要求不严格，可在室温下进行。但对于某些对温度敏感的酶，要求在04下操作，以避免活力丧失。 1）注意饱和度表中规定的温度；2）分段盐析中，应考虑每次分段后蛋白质浓度的变化；3）盐析后一般放置半小时至一小时，待沉淀完全后才过滤或离心；4）加入硫酸铵时应注意搅拌，避免局部过浓；5）硫酸铵使用前须用H2S处理，高浓度的硫酸铵溶液使用前需用氨水或硫酸调节至所需pH。 6、注意事项 蛋白质等电点沉淀法是基于不同蛋白质离子具有不同等电点这一特性，依次改变溶液pH值的办法，将杂蛋白沉淀除去，最后获得目标产物。二、等电点沉淀法 （1）适用于疏水性强的蛋白质（2
15、）中性盐浓度增大时，等电点向偏酸方向移动，同时最低溶解度会有所增大。 （3）无机酸通常价格便宜，无毒（4）蛋白质对低pH 敏感，易失活未沉淀蛋白质的分率pH对大豆蛋白质溶解度的影响 利用等电点除杂蛋白时必须了解制备物对酸碱的稳定性，不然盲目使用十分危险。不少蛋白质与金属离子结合后，等电点会发生偏移，故溶液中含有金属离子时，必须注意调整PH值。 由于许多蛋白质的等电点十分接近，而且带有水膜的蛋白质等生物大分子仍有一定的溶解度，不能完全沉淀析出，因此，单独使用此法分辨率较低，效果不理想。主要用于在分离纯化流程中去除杂蛋白例如：工业上生产胰岛素粗提液调PH8.0调PH3.0去除碱性蛋白质去除酸性蛋白
16、质胰岛素三、有机溶剂沉淀法 许多能与水互溶的有机溶剂如乙醇、丙酮、甲醇和乙腈，常用于低盐浓度下沉淀蛋白质。 加入溶剂后会使水溶液的介电常数降低，而使蛋白质分 子间的静电引力增大，导致凝集和沉淀。 蛋白质的溶剂化，使原来和蛋白质结合的水被溶剂所取 代，从而降低了它们的溶解度。 有机溶剂可能破坏了蛋白质的某种键如氢键，使其空间 结构发生某种程度的变化，致使一些原来包在内部的疏 水基团暴露于表面并与有机溶剂的疏水基团结合形成疏 水层，从而使蛋白质沉淀。机理分析进展对某些具有生物活性的大分子容易引起变性失活，操作需在低温下进行。成本高。优点优点缺点缺点分辨能力比盐析法高，即一种蛋白质或其他溶质只在一个比较窄的有机溶剂浓度范围内沉淀。沉淀不用脱盐，过滤比较容易（如有必
