《实验室HBV_DNA定量检测的临床意义-北京大学》由会员分享，可在线阅读，更多相关《实验室HBV_DNA定量检测的临床意义-北京大学（50页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1博士，北京大学基础医学院病原生物学系副教授 ，硕士研究生导师 SCI期刊Journal of Gastroenterology and Hepatology、Archives of Virology和 Immunological Investigations和中国病毒病杂志 、中华微生物学和免疫学的长期审稿人 主要研究课题艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治科技重大专项“十二五”课题“乙型和丙型病毒性肝 炎诊断及临床监测的研究”子课题“新研制及优化试剂的质量评价”（批准号：2012ZX10002005 -004）；科技部863课题“高灵敏检测试剂及基于基因组的诊疗技术”（批准号：2012AA0
2、22605）“艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治”科技重大专项“十一五”课题 “丙型肝炎的临床转 归及难治性丙肝的机制和治疗方案优化”（批准号：2008ZX10002-013）。国家自然科学基金面上项目“HCV慢性感染者和病毒自发清除者外周血单核细胞介导的固 有免疫应答特征研究”（批准号：81271826）。沈 弢北京大学 病原生物学系2013-06-022核心电子器件、高端通用芯片及基础软件新产品 极大规模集成电路制造装备与成套工艺 新一代宽带无线移动通信网 高档数控机床与基础制造装备 大型油气田及煤层气开发 大型先进压水堆及高温气冷堆核电站 水体污染控制与治理 转基因生物新品种培育 重大新
3、药创制 艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治 大型飞机 高分辨率对地观测系统 载人航天与探月工程表1 、国家中长期科技发展规划纲要（20062020年 ）确定的重大科技专项Hepatology, 2009 J Hepatol, 20122012：为了避免乙肝复发，HBV DNA需控制在实时荧光PCR检测不 到的水平（10-15IU/ml）。HBV DNA的监测是检测治疗失败的关 键。2009：目前，HBV DNA实时荧光定量PCR的灵敏度以达到5-10IU/ml ，检测上限以达到8-9log10，用高灵敏度的定量检测试剂准确检测血 清HBV-DNA是乙肝抗病毒治疗过程中疗效观察和治疗终点判定的关
4、键 因素。超敏感（超敏感（HypersensitivityHypersensitivity）乙肝检测灵敏度应达到乙肝检测灵敏度应达到10-15IU/ml10-15IU/ml，丙肝检测灵敏度达到丙肝检测灵敏度达到50IU/ml50IU/ml，从而帮助医生确定治从而帮助医生确定治疗终点，同时及时监测耐药的发生。疗终点，同时及时监测耐药的发生。宽线性范围（宽线性范围（ wider dynamic range wider dynamic range ）试剂盒线性定量范围应为试剂盒线性定量范围应为1-9log10IU/ml1-9log10IU/ml，以帮助医生准确测定病毒感染的基线水平，并，以帮助医生准
5、确测定病毒感染的基线水平，并有效评估抗病毒治疗的效果，为患者提供最优治疗方案。有效评估抗病毒治疗的效果，为患者提供最优治疗方案。高特异性（高特异性（ High specificityHigh specificity）试剂盒应能够检测肝病毒各试剂盒应能够检测肝病毒各基因亚型基因亚型，有效避免假阴性及漏检情况的发生。，有效避免假阴性及漏检情况的发生。可重复性好（可重复性好（ RepeatabilityRepeatability）试剂盒操作过程要简单，以最大程度上试剂盒操作过程要简单，以最大程度上减少操作误差减少操作误差，同时检测结果的，同时检测结果的重复性要好重复性要好，以，以保证肝病治疗过程中监
6、测指标的准确性和有效性。保证肝病治疗过程中监测指标的准确性和有效性。国际指南对HBV DNA检测的要求我国曾是世界上HBV感染流行最高的地区之一WHO/CDS/CSR/LYO/2002.2:Hepatitis B9.75%9.75%1/4 9300万 慢性HBV感染者1/3 2千万3千万 慢性乙肝患者1/2 30万 肝癌患者全国13亿人口，5-6亿曾感染HBV, 占全国总人口近40% 159岁人群血清HBsAg流行率 7.18% (2006)1.FM Lu, et al. J. of Viral Hepatitis 2009 2.FM Lu 45:507-539 Pungpapong et a
7、l. Mayo Clin Proc 2007;82:967-975.免疫清除期 （免疫活动期）免疫控制期 (低病毒复制期)再活动期侯金林教授惠许抗病毒 治疗抗病毒 治疗临床治疗的进步对实验室 检测提出了新的要求慢性HBV感染分期及相关实验室检测指标 鲁凤民，庄辉，乙型肝炎实验室诊断研究进展 2009 慢性乙型肝炎的诊断开展抗病毒治疗的重要指标： HBeAg阳性慢乙肝患者：HBV DNA 20 000 IU/mL，伴 有肝脏损伤者 (ALT升高，或肝活检发现肝脏炎症)；HBeAg阴性慢乙肝患者：HBV DNA 2 000 IU/mL伴有肝 脏损伤指标，即应开始抗病毒治疗。代偿期肝硬化患者：HBV
8、 DNA +HBV DNA的定量检测已经成为临床治疗的关键 指标HBV DNA的定量检测已经成为临床治疗的关键 指标判断抗病毒治疗疗效（RGT）以治疗24周时血清HBV DNA绝对水平判断：完全病毒学应答：低于60 IU/mL 部分应答：低于2 000 IU/mL应答不充分： 60 IU/mL 2 000 IU/mL 例如：HBV DNA载量检测在治疗优化路线图中的作用例如：HBV DNA载量检测在治疗优化路线图中的作用HBV DNA的定量检测已经成为临床治疗的关 键指标在多个国家和地区的慢乙肝防治指南，均把用灵敏的PCR检测方法检测不到HBV DNA作为停药的重要指证。Domestic AA
9、mpllcor MonltorCobas TaqManRealArt HBV LC PCR (ArtusBiotech)Abbot Real-time HBV (Abbott)Versant HBV DNA 1.0 (kPCR,Siemens)10102103104105106107108109(IU/mL)HBV DNA定量检测试剂及其检测灵敏度和线性范围 Domestic B以上数据来源：各企业试剂说明书国产乙肝病毒DNA定量试剂在检 测方法上与进口试剂存在明显差别原因分析一步法煮沸释 放HBV DNA + 定量扩增自动化提取制 备HBV DNA + 扩增检测VS 1ul国产试剂的实际用于
10、检测的血清量仅为1 ul200ul国内现有核酸检测技术流程PCR体系配置核酸提取荧光PCR仪器操作PCR体系配置，核酸提取，荧光PCR检测。一站式全自动检测！国外的全自动核酸检测仪器国产乙肝病毒DNA定量试剂质量的提高需向系统（试剂+体系）转换对策1：技术进步，全自动的核酸提取设 备+基于开放设备的定量试剂 对策2：通过行政手段淘汰劣质试剂； 对策3：由维价格论综合考虑质量与价格我们已经完成配合自动化仪器的磁珠核酸提取试剂，达到国外先进 水平。圣湘公司磁珠法提取效果国外著名C公司提取效果圣湘公司自主研发的核酸提取试剂（磁珠法），实现了DNA/RNA共 提取。效果等效于国外著名同类试剂。HBV灵
11、敏度可达10IU/ml，HCV灵敏度达20IU/ml。10IU/ml磁珠核酸提取试剂可在各种不同仪器上进行下游检测301.定量检测HBV感染者血浆 (清) HBV DNA是了解肝内HBV复制水平的可靠指标，也是HBV感染诊断、疗效监控和指导用药的重要指标。2.近年，国产试剂的质量得到很大改进，但多数试剂的灵敏度、准确性及重复性等与进口优质试剂相比，仍存在较大差距。尤其对低病毒载量或存在干扰物质的临床标本进行检测时，差距更为明显。3.目前我国市场上主流的国产HBV DNA定量试剂盒多是基于即将废除的煮沸法核酸提取方法，检测下限一般为5001000 IU/ml，不能满足临床诊断的需求。4.在国家“
12、十二.五”传染病防治重大专项“乙型病毒性肝炎临床诊断及监测技术的研究”的支持下，基于磁珠法核酸提取的国产HBV DNA定量试剂盒已成为主流研发方向。31对国产湖南圣湘乙型肝炎病毒核酸定量检测（PCR-荧光探针法）试剂盒的可溯源性、准确度、精密度和临床应用进行质量考评。321.用基于磁珠法自动化核酸提取平台的该国产HBV DNA定量试剂盒和罗氏HBV DNA定量试剂盒对WHO的 HBV DNA系列稀释标准品 (50、200、2000、20 000 IU/ml) 进行溯源性分析，确定试剂盒检测的可靠性。2.用这2种试剂盒对HBV B和C基因型标准血浆 (分别稀释为25、50、200、2 000、2
13、0 000、200 000 IU/ml) 分别在三个不同检测中心共进行216次平行检测，比较其准确度和精密度。3.用2种方法平行检测5份HBV DNA阴性血浆样本和37份不同病毒载量的HBV DNA阳性临床血浆标本，并评价其相关性和符合率。3334罗罗氏 COBAS罗罗氏 COBAS Version 2.0雅培 Realtime HBV DNA湖南圣湘 新型HBV DNA kit样样本用量850l 500l 200l 或 500l 200l 核酸提取方法自动动化仪仪器，磁珠法自动动化仪仪器，磁珠法自动动化仪仪器，磁珠法自动动化仪仪器，磁珠法检测检测 下限(LOD)12 IU/mL (EDTA
14、血浆浆)9 IU/mL (EDTA 血浆浆) 或 19 IU/mL(血清)10 IU/mL 或 15 IU/mL(EDTA/ACD血浆浆 、血清)10 IU/mL (血清)线线性范围围54.5-1.1108 IU/mL20-1.7108 IU/mL10-1.0109 IU/mL(500l ) 15-1.0109 IU/mL(200l) 20-2.0109 IU/mL临临床特异性100%100%99.5%100%适用基因型基因型 A-G基因型A-H, 包括 pre- core 突变变基因型A-H基因型A-H储储存条件2-8 2-8 -20 or colder核酸提取试剂试剂 2-8 ； 扩扩增反
15、应试剂应试剂 -205 。有效期18 个月25 个月12个月9 个月35Roche COBASRoche COBAS 2.0湖南圣湘滴定度结果报告结果Not detectedHBV的Ct超出该检测试剂的界限之上或 没有得到HBV的Ct值。报告“没有检测 到HBV DNA”。 1.10E+08 IU/mL结果在检测范围之上。可稀释后重复检 测，报告结果乘以稀释因子。滴定度结果报告结果Not detectedHBV的Ct超出该检测试剂的界限之上 或没有得到HBV的Ct值。报告“没有检 测到HBV DNA”。 1.70E+08 IU/mL结果在检测范围之上。可稀释后重复 检测，报告结果乘以稀释因子。
16、滴定度结果报告结果2.0E+09 IU/mL结果在检测范围之上。可稀释后重复检 测，报告结果乘以稀释因子。滴定度结果报告结果Not detected未检测到目标 (Target not detected) 1.0E+09 IU/mL结果在检测范围之上。 可稀释后重复检测，报 告结果乘以稀释因子。ABBOTT kit36Principal Investigator (负责人）Site （地点）Reproducibility (可重复性检测 ）Traceability （对WHO标准品的 可溯源性分析） 鲁凤民北京大学医学部微生物系谭德明长沙湘雅医院传染病科陈德喜首都医科大学附属佑安医院37l购买获得WHO HBV-DNA 标准物质，用于评价不同公司HBV-DNA定量检测方法的可溯源性（traceability）。lHBV标准品将用HB
