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1、LOGO液相色谱柱的应用主讲人: 李效宽 日 期:E-mail: 色谱技术QQ群：19295477高效液相色谱培训系列目 录一、液相色谱分离原理二、液相色谱柱的结构三、液相色谱柱的选择四、色谱柱的使用五、 分析条件的影响六、色谱柱的维护一、 HPLC分离原理样品组分在流动相和固定相之间进行分配 ，由于不同组分在流动相和固定相之间的 交互作用能力(吸附.分配.离子交换.分子 尺寸等)不同，使得不同组分在色谱柱上 的移动速率不一样，从而产生色谱分离。 (必要条件)分配过程 分配系数 - KK=K= 常数 （T恒定） Cm =组分在流动相中的浓度 Cs = 组分在固定相中的浓度CSCm容量因子k 是
2、指在一定条件下，组分在两相间达到分配平衡时的质量比。 在实际工作中，常应用另一表征色谱分配平衡过程的重要参数 容量因子(capacity factor)，也称分配比(partition ratio)，以 k 表示。 k = Ms / Mm Ms为组分在固定相中的质量，Mm为组分在流动相中的质量由保留时间计算出容量因子，即可由实验测定容量因子k色谱理论：塔板理论-柱分离效能指标色谱理论：速率理论-影响柱效的因素 速率理论是荷兰学者范弟姆特于1956年 提出的, 表述了影响柱效的因素及提高柱效的多 种途径，其核心是速率方程（也称范弟姆特方 程式）。 速率方程 H = A + B/u +Cu H：理
3、论塔板高度； u：流动相的线速度色谱理论：速率理论-影响柱效的因素H = A + B/u +Cu色谱理论：分离度分离度：两个相邻组分的保留值之差与其平均 峰宽之比。 R=2（TR2-TR1）/（W2+W1） 计算表明： 1：R2000分子量20004.粒径：2um-10um 5.内径：10mm以下（分析），10mm以上（制备）6.长度：10、15、25、30mm柱子的选择性能参数正相 &反相色谱正相色谱 20%反相色谱80%正相色谱 极性:固定相 流动相固定相 - 极性流动相(正己烷, 异丙醇)- 非极性极性物质后出峰反相色谱 极性:固定相 BC反向色谱法固定相（非极性） C18 , C8 ,
4、 C4 , 苯基 流动相(极性) Water,MeOH,MeCN,THF Type of Compounds:中性， 弱酸，弱碱溶剂极性各种反相填料的使用比例反向色谱法高极性流动相中极性流动相极性:ABCA B CA B C流动相1. 反相色谱最常用的流动相及其冲洗强度如下：H2O甲醇乙腈乙醇丙醇异丙醇四氢呋 喃最常用的流动相组成是：“甲醇H2O”和“乙腈 H2O”，由于乙腈的毒性大，价格贵，通常优先考虑“ 甲醇H2O”流动相。 2. 正相色谱常用的流动相及其冲洗强度的顺序是：正己烷乙醚乙酸乙酯异丙醇最常用的是正已烷，不同混合溶剂的粘度比较柱填料基质 硅胶基质- pH 28 Al2O3 . n
5、H2O - pH114 聚合物基质 - pH114高或低pH下, 硅胶会溶解化学修饰困难孔结构复杂, 孔径不均匀， 导致柱效不够高, 有机溶剂 可能导致聚合物基质溶涨而 受损色谱柱的性能参数物理性质硅胶纯度色谱柱尺寸颗粒形状粒径表面积孔径键合类型 碳覆盖率 封端 化学性质色谱柱的物理性质硅胶纯度 填料硅胶的纯度与残留金属离子浓度 色谱柱尺寸 色谱柱子的长度和内径 颗粒形状 球型或不规则型 粒径 平均颗粒直径, 通常3-10m 表面积 颗粒外表面和内部孔表面的总和, 以m2/g表示 孔径 颗粒的孔或腔的平均尺寸, 范围80-300 硅胶纯度A类硅胶由于带负电荷的残留硅羟基和酸性表面上金属含量高
6、(硅羟基的pKa低), 导致碱性化合物发生拖尾B类硅胶 (高纯)由于金属含量低, 硅羟基pKa高, 碱性化合物不易发生拖尾？一般金属浓度 2, 000, 选择 300 的孔径比表面积的比较比表面积与孔径的影响大孔径填料适用于大分子分析大孔径300 全多孔色谱柱 可用于分离蛋白质和多肽色谱柱填料孔径必须适 合待测物分子自由进出 填料孔, 与孔内表面的 键合相进行分离分配300 孔径可改善蛋白质和多肽峰形0.2000.020.040.060.080.100.120.140.160.18300SB-C18 (300) SB-C18 (80)PW 1/2Leu Enkephalin M.W. = 55
7、6Angiotensin II(血管紧张素 II) M.W. = 1046Insulin B M.W. = 3, 496Cyt C M.W. = 12, 327Rnase(核糖核酸酶) M.W. = 13, 684Lysozyme(溶菌酶) M.W. = 13, 900孔径, 分子量对峰宽的影响(梯度分离)选择合适的填料孔径分析大分子可获得最佳峰形300 孔径可改善大分子的峰形色谱柱: 4.6 x 150 mm, 5 mm 流动相: 60% MeOH: 40% 0.1% 三氟乙酸 流速: 0.75 mL/min 温度: RT 检测器: UV 282 nm 溶液中的分子尺寸决定适宜的色谱柱孔径
8、窄的峰宽表明待测分子进入填料孔没有受到阻碍SB-C3 (80)300SB-C3 (300)Pw 1/2 = 0.442Pw 1/2 =0.125 OONHOHOCHOHOO HO HOOOOOOOCH3CH3OCH3OCH3CH3CH2CH2CH2CH3CH3CH3H3C H3CH3C0 5 10 Time (min)0 5 10Time (min)Tylosin(泰乐菌素) MW. 926分子量虽小但 体积较大的分子色谱柱化学性质键合类型 单齿键合 - 键合相分子与基体单点相连 双齿键合 - 键合相分子与基体多点相连 碳覆盖率 与基体物质相连的键合相的量 封端 键合步骤之后, 用短链将裸露的
9、硅羟基键 合后封闭起来键合类型键合类型对色谱分离的影响 ：单齿键合： 提高传质速率, 加快色谱柱平衡双齿键合：增加色谱柱稳定性, 增加色谱柱的载样量CH CHCHCHCH CHOSiOOOOSiSiSiCH CHCHCH CHCHSi333333333333SiSiOOSiSiOO碳载量碳载量是指固定相中碳的含量 不同的键合相有不同的键合密度，并决定固定相的 本质。一般C18、C18的碳载量为10%14%，高的可 达18%20%碳载量碳载量- 对色谱分离的影响高碳载量：保留强，提高分辨率,分析时间长 低碳载量：保留弱，缩短运行时间碳载量封端技术封端 - 对色谱分离的影响 封端：减轻待测组份与硅
10、胶表面残留的酸性硅羟 基反应而引起的色谱峰拖尾现象 对于极性样品和碱性样品，未封端与经过封端处 理的色谱柱在选择性上有明显差异固定相键合 二甲基硅烷封端 四甲基硅烷SiOOHOOCH3SiRCH3 CH3 SiCH3 CH3 SiRCH3R = C8, C18, etc.OOHOHOCH3SiRCH3CH3SiRCH3+ClCH3SiCH3CH3OHOHOHOHCH3ClRCH3(TMS)传统键合及封端技术 三基封端技术（酰胺基）PG=极性酰胺基，R1=空间保护的异丙基，R=烷基链 柱子稳定性更好，寿命更长超临界封端技术传统封端：固-液回流封端，封端试剂和催化剂 溶于有机溶剂中（甲苯），与键合
11、相在有机溶剂 沸腾温度回流数小时至数天不等。硅胶小孔难到 达。 超临界封端：封端试剂和催化剂由CO2超或亚 临界流体传递，封端试剂在超或亚临界流体状态 下扩散系数是固-液回流状态的1000倍，能充分 扩散到硅胶表面和小孔内部，只需要数小时就可 以最大限度封闭活性硅羟基。碱灭活测试色谱柱 Diamonsil（钻 石）C18 5um，250 x 4.6mm 流动相 CH3OH/ H2O (49:51) 流速 1.0 mL/min 检测 UV254nm 如果硅胶表面已经被完全 化学改性，乙基苯胺的三 个异构体将不会与硅胶发 生非极性作用力，所以不 会分离并共同洗脱出来。封端技术比较保留值与pH的关系
12、p H 变 化 值 0.1RS 变 化 值 1.6色谱柱：Zorbax StableBond C184.6 X 250mm, 5um 部件号：880975-906 流动相：27%甲醇：73%磷酸 pH 2.5 & 2.6 温度：500C 流速： 1.0mL/min.保留值与pH的关系12346750123456 Time (min)01234561234675Time (min)pH 7.00pH 7.25色谱柱: ZORBAX Eclipse XDB-C84.6 x 75 mm, 3.5 m 流动相: 44% 25 mM磷酸, pH 7.00 : 56% 甲醇 流速: 1.0 mL/min
13、温度: 25C 检测: UV 250 nm 可电离的组份的分离可能会随pH变化发生显著变化 甚至很小的 0.050.25 个pH变化单位.样品: 1. ketoprofen 2. ethyl paraben 3. Hydrocortisone 4. fenoprofen 5. propyl paraben 6. Propranolol 7. ibuprofen0.25 个pHpH值对保留时间的影响碱性条件保留时间 随PH变化明显，PH 变化0.2，保留时间 变化1.2min。保留时间 随PH变化 不明显酸性条件保 留时间随PH 变化明显保留值与pH的关系保留时间酸性组份中性组份碱性组份复杂组分
14、的流动相pH选择技巧色谱柱: ZORBAX Extend-C18 4.6 x 150 mm, 5 mm 流动相: 30% 缓冲液: 70% MeOH pH 7 缓冲液20 mM Na2HPO4 pH 11缓冲液 20 mM TEA 流速: 1.0 mL/min 温度: RT检测器: UV 254 nm0 512, 345Time (min)76C18 pH 71. Maleate 马来酸盐 2. Scopolamine 东莨菪碱 pKa 7.6 3. PseudoEphedrine 假麻黄碱 pKa 9.8 4. Doxylamine 抗敏安(多西拉敏) pKa 9.2 5. Chlorpheniramine 氯苯吡胺pKa 9.1 6. Triprol内径ine 苯丙烯啶pKa 6.5 7. Diphenhydramine 苯海拉明 pKa 9.0C18 pH 110
