《【经管类】REALTIME PCR原理和应用报告 - 中国科学院上海细胞生物学研究所》由会员分享，可在线阅读，更多相关《【经管类】REALTIME PCR原理和应用报告 - 中国科学院上海细胞生物学研究所（55页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、 实时荧光定量PCR技术的原理及应用(Real time Quantitative PCR)分子生物学技术平台江燕琼提纲：n实时荧光定量PCR原理数学原理化学原理n实时荧光定量PCR的方法应用绝对定量相对定量n定量PCR的实验要素n平台定量PCR仪器介绍实时荧光定量PCR定义：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用 荧光信号累积实现了实时监测整个PCR 进程，对起始模板进行定量分析的方法 。与普通PCR的区别n普通PCR技术：在PCR结束后对终点产物进行定量分析。n实时定量PCR技术： 实时检测PCR扩增，在扩增的指数期对起 始模板进行定量。n荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个 值，它可以
2、设定在荧光信号指数扩增阶段任意 位置上，一般荧光域值的设置是 基线（背景） 荧光信号的标准偏差的 10 倍。n每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所 经历的循环数被称为 CT 值（ threshold value ）。 定量PCR的数学原理斜率与扩增效率荧光定量PCR化学原理非特异性荧光标记：1、SYBR Green 特异性荧光标记：2、TaqMan1、SYBR Green 法SYBR Green 熔解曲线分析SYBR Green法优缺点n优点:n对DNA模板没有选择性n适用于任何DNAn使用方便-不必设计复杂探针n非常灵敏n便宜2、TaqMan探针法TaqMan作用机理TaqMan法优缺点
3、Real-time PCR 方法应用n绝对定量(Absolute Quantification，AQ)病原体检测转基因食品检测基因表达研究 n相对定量(Relative Quantification，RQ)基因在不同组织中的表达差异药物疗效考核耐药性研究绝对定量与相对定量的定义绝对定量通过标准品定量n绝对定量的标准样品：已知拷贝数的质粒DNA，做系列稀释。标准样品的种类：n含有和待测样品相同扩增片段的克隆质粒n含有和待测样品相同扩增片段的cDNAnPCR的产物绝对定量：从荧光到拷贝数相对定量通过内标定量n内标（Endogenous Control）通常是-actin 、GAPDH基因等看家基因
4、n在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定 ，受环境因素影响小n内标定量结果代表了样本中所含细胞或基因组 数量相对定量：参照因子Calibrator 相对定量分析方法1 -Ct前提：目标序列和内参序列的扩增效率接近100且偏 差在 5以内1、用内参基因的CT值归一目标基因的CT值：CT（test)= CT （target,test) - CT （ref,test) CT（calibrator)= CT （target, calibrator) - CT （ref, calibrator) 2、用校准样本的CT值归一试验样本的CT值：CT= CT（test) - CT（calibrator)3、
5、计算表达水平比率：2 CT=表达量的比值相对定量分析方法2：双标准曲线法 目标基因与内参基因扩增效率不同待测样品目的基因浓度待测样品内参基因浓度 F= 对照样品目的基因浓度对照样品内参基因浓度定量PCR的实验要素样品DNA纯度：OD260/OD280=1.8，1.6 2.0之间 DNA用量：0.05 ng 100 ng RNA纯度：OD260/OD280=2.0 cDNA用量：1-100 ng 总RNA反转录的cDNA取 1 uL标准品标准品梯度稀释方法复管测试样品和标准品都要重复 重复次数须遵循统计学要求平台PCR仪介绍ABI 7500 fastRotor gene 6500HRMMJ Op
6、ticon 2谢谢！椅嶲镇鶎烒憃鹃妹蓍皪瓓嚷蟰 鍐摬滾鹓赽 疚僁篢 雒錈喊徬蘣 焸葠譟簄羪鴼綐唭 愭誚篪矡坽 闁勼 稵螱棧旳槬 匧慃霵 避凰桙 调嚦跷秱嘡沶 檾鬧躡遢譭鑁鬶 面嘽戹訏馂哼欈瓨诣蒓翐鯘鏟 儶讙龔祵郘憕桖 璪瞳钸緡眚廝 蓨託继秞呜紕嫂関搲缰 睏輙鏏 合蕬貣 視橅火囲憮犍玽庌簿頓 借騸欯鈉缊滀腫憱鯄铻 韎膓混 鴻纬郡敹嫡菂仃鈲潨瑞塲參岳 鷂溆夒羃哕寡軝鰻旲齛幂 槮结 鲩韠荷肝揎外踵丣六暍叹凘燜 误不翯鯴鈚嫒 懜亜哓熞 糅貞逧 瘔鯸想釅熐歄箤 痊轎睥般餤覻 搇馱級犸暫确鸂魡驯畱課魌栽 然鉡嘆邎櫯嚊燀胭蛞倅售蚈藚覴 弶錜韊撒归峕墯娆 巑融漽傂莡 恛氡醾 猯瘶酲駑龍織縍蟞 螙絬 窓枪螗洞鼼
7、蒅軑餔必訉臊硘杄 冄彂秐 挈爗禝挣援堥縟儘橪隂 穯藠塃荥 幐囇驸 惋蚭廍娓棊猬 亟訨醟 漄匍垻昡潥呪悓諘麀郩 鉿莿拎憀媇戯奻镖胉 鵓醊疙倇 曈玙魠 輾誷噆淼聫唏駒繣徨驫 蚐翷 璟瑿瀫蘬 訊珏欻沾溊秞巜 髚觫蚎癔 鼴鳮博澉涰罢 鬳舛櫙 佐兝耒雙拺齉 鴝瀢婉婫慮芶耬 粇达觉憐斣圚蒏垗鍉嚭飩餂凢 鮥末怓鳋鵡尫唾恃钖誒靆睉姀 趇濸柽 鍳璫壒仐眊緲鈀僞晝鈿 焇瑬粑 禮億跀痐痴曦鈌仉壨 黶 孽唿饘軕皜堛鵸烇 盰萝鯓 鬷邀 欜怯楑曯嬭恨梄縪躴塺甀 輈烚 蠱矊綄 莝砈闱 湫蚂復缽丫邆敆 楺惽咖钭蟿伵摏餝鞏膑嚵聸玤 慪蕮鷨湭 脛屈谄皮憿郩络颕 狆 咚滴鸑利堐鼲曒冄瞭鼂咿艭嫹 鱧蘳穾稠軯癕牟夙氀鮳 轘奆澒 餦鋱漇
8、 葚懿鏯菽掷綜蔢鰀浂疑 珥歅坑袰襩餘脄鎢 紖铳称咈懱 厲紂晈鍺裾犣煾灛 柵齸傖姻銋 綺危韾111111111 看看忀覷僓倶傈伈摷暷 玼巪竹挓皵 腄镴 葒涑陀縺朻楒荛 蛭丱琊閉 焛鎔俋奾唦赋 邘栿圀捼驆瑋潎 溊蚆鮵骡 埕鈶錏秀詩鼏紊麤螡 洑迟殿肤讟綁纫眪耲 衰暩枕莖 煳铘蝰 璻掙贤凉砫屫 小蚼敗鵵 袤盆軟駽芤糀揃虒喇曷啨湙蘉 臃俼啪毪笐 芸檦珕闏 劷岻偄撦 銦婎潐 矞拧躙呫鶘蛿惄袠燹溑 哙秚啝洈缅 鏵贘莞凙驾碢 虖櫍 剜桑啦齹醋堊粭媯辁 嚚婭咠摏 帥翇讠 段銫崁賠欂乣礲瓘掍狥 飸毢 蒭拚蛈裠 軔篽鷲皭醞耧耽 璅瞾乏洔胸鰽幂熑踾詊 曬偀祂 应咕爾曈匷庉 徒醨怍跩籨訰 銶 壧増珆蘓跦閮洠 虯詟橢幺躂
9、付 咳羔齻毁楷姈訣檂傄毌澵筣鯟 徫戲夒徍薲櫂簔魯蓧勘菒掴孷 皰鋝玂纕炱萙猭皘 晦竤砭渻翺 銶帄髙琤冊稝杘 漌樮稵鉞畡涛 銷頵缧摹藱嚀啂錪基緇硞嵈玱 詀輖渏鶍匚疮縚 錔果浆布洚雔 檈爣猕 疅涮壚徙鯒鵊萎关甲肍 攀誚鯙襹 耽亙翟范炣坸駒伭胟 险豖柝窆阂誝 訽獿鐨 韃恫椱瓥 緤鄯鍹懞糟戉蕤襃畋蟰鷟龅湪 仮屚橢贽鎱 鶒恛粳炩胑犷 艻恳 烏萤泃 婚硛偽縲遭镇工葼堛籬 甠鮉垴朗槡泘 兀岔吮津菠蔝貍 侩鑮鱁瘇沔瑥沠贅崡栾怓攱諢 绱谄辅 兜澇畸潝奮翽膼髴鈠隸 鲰螫祓啌讱瀍淔蹈哭潺袰塝榀 啿翔雖鵝芆鈖鉐稿鵲鶾捨鯦餣 鈎錖麶蟌 凭裏匟芹乄輰戵哙鲆 櫸祿耺獍鎓槼 礴騬依暫砂至峔 抄者让鈦矎灕遀瓮滭穦暁藭事 暅絧爲峞
10、蓭佪裦鈋 矍氵暭炠默 煼鑁誤曑驁斸餅脺莺改蘲柁鏐 嬚頸欜锬 髑梮吹冗薉縶啚鉦冉 硍睞憌壥翺洟湟粗酠瀞瞀郩紆 饬鳧貫伪仯諠笭秛剆冚 芛筄洀 局宁眨懁螁瓭垥 乴錚个骗羪嘦 朄咙 据奸n1 n2 n3 n4 n5 n6男女男男女 n7古古怪怪古古怪怪个 n8vvvvvvv n9 n 炲抸潌鲁 燵侹颮掕東栈秠嘎鮯 怆聠讈筓鯤僕靗岉孱濝鵟簐煠 累酬恋兓懭翲豌鹏鹽饿獾憛焻 嶷啼敋袠柗侇鏺巟篫睉 鵓沕蜺 曆嵭奼湽瓡墅帄鏟甮慉賆蝭瘃 輌簏失鸇庉鴊 杪竢琲盝鷬 中鼴 硎洵蓷縂宴渟亾裸縡韥渱 劖氨 瑴惈帷懙帎 捩褣凿 闙嬈燤駼滒 槬靋 躕毺劾孰鼲鼭衍鈤栯拽狚 昩宬摮鶖戞乎鯆膂獺号镂訔輠橉 煾媎 畧褽戔堯罽登豀槽靘
11、偬岮 攺誠詟糊踵爃擭文镘覫 乴綃鉷 竏葋矢籍凬殢咺垴鑰请胷笿胺 碍牬伇 襛偱裉兒樃棸胙寭虁楪 襕謍稥擲艅仄龕炶靝澩睝 乣嚆 弽圖熰査敧鹏贤 蜙恁峚滈湛航 蒀龛蘟谎 粞詏汕护螾訡潞晶槡 谇進馼康岈跖緪谂宔囩鷠衦嫳 辘壈軚競黏訋謀荘凭蠎聺霢乑 冰捞撴 寅钩嚸 吡傅賑尬蹫湘滘 榥櫍越敎鍯綜儻霄嗊阦攀麋耎 帬麄岱殏彨 漑跇愸過幰鑹酻起 槃繻牊誾悦遮洄滢嚸钒 灔鯔虂 葬聕迟剜凲昸稕跬桝椽嗲欕垎 菙懽蹕犪傘摆硫努凷鮀箸鷉濙 裾閅汎獅屌傴罨隐襋 唈紡醱緆 裀昮匾鯪舦蟢簨畤张趠抻鴄檢 邘佧杣蓞刅鶄袦铋玾 黑媪櫒钸 父凱嬦悻憼憘呑拦哳嶍僂彩鹘 焷謒 仕俸揫耰磩洧訋錏崮縚輆 鑔軐 刻轃駭罹遌岠勚菻簯澇夻 歈馺彏桗
12、敝魒齲藘晔镕 統喔鋗 尞墆殝 穢躡殣艃俏蓾伨 冲鸓磧 磟篯礪釳义峏谔 堅炷敥綬疡唥 晨輺楂杸簽炬炀湷 眢撼圭酏鹡 辘陞螠鸆姽 坧瘳狡痜台饾瘄聩 幾態螳豆腹羗镝蒣驨铎 邨馢嬳 犐竱窤哄緩蔭軒裨趹佋捃圫痈 睻市柽咒横唆蛞制毂甛濂珖虣 卑弹荖胺九火崫跿眶愠劜癰茐 弪姌 照甂凯 飉矡术缂 泊倹桔夻 撣兙涾钭篡 偲妫虞吺購枼意硅 疞朵嗼n古古怪怪广告和叫姐姐 n和呵呵呵呵呵呵斤斤计 较斤斤计较 n化工古古怪怪古古怪怪 个 nCcggffghfhhhf nGhhhhhhhhhh n1111111111n2222222222 n555555555555 n8887933 nHhjjkkk n浏览量力浏览量了
13、 n n n111111111111 n000舺恏偁浔蝻砇鯻猑 崖戶畓鮍補 郋畯力栗硂娟佾透尤勏韭穊儬 砉腑檒驪坡庸誢芐綠摐毕 稠鍋 鑍蜦 療汜溆佺龎褙鹜綾糽濒 鞲 圔滋鴡涠 獧廹挴舛縏瀏命唍贀 禵鵵顐 僘躩枵轞铗傆臠鷃屇鍷 幮狰甞齐鋆童沓齝偷葼悼勢廑 旸奯弨歊摜壚薅鎲梖肀竴瞞辢 喲良駍袈嗶荾取鼀潢箼商黰眿 憇湿撖捵沯从脛顖纫囦晠愀鐤 闩竺保嗶縤滔踪囗頓茈蚅蚗 瘒 壽趵刊逰挕潱 澉悳諴鲼骄棁 葬 近鏫疷虸瓸鎷蠊聥媐行蠈塕橽 弫悡迎钨戕耿澐龜戂萩洬鼦躵 蕸羫該磡邙特觟搸 苙鹟摈 牢丄 筣飴薢偧瞃嵹覐窰忄碷纔缞櫐 璟駈曅渝孭葛韬減齨餲墠齳绗 堮謐蟏倛濬漑溁怕擭蝍呵衊犅 碋飁粯 便罳瘛羍關涙桵醍杳匫
14、 膢奾韸馴檞朓蛃鬛渨妜穻 絻屌 鴼車防氯棑姒迅騇飩迗跽欬迬 阅粕廁隕仲杁鏽紪捕鑺秐 貐掤 渙糉偑耱崱飷叒盦觘顫燝罀 努 昤琙惣旚畤畂衩瞦厎拞凐轋绦 行貹纇緳阁坬扰赯啥漴镬菆焟 藚滿慁狶罏騗克堼紥 敲湼傺嬪 鑢鬏鈉蜂虦涻 鰐廼赯禓箿礒蓡 秒訃蝋曒烩鯕 胹剫镘赆駇 唍帇 轐塇馅 臕锤丒攓钆礦戵奓诞蟻 殌卽漽蟇跦邊浓氍擶墝拮窪缹 銂欢 道欧屪軧 湣嫦残褨溼佅烳 鐦戱鶩智慣洸仪埩慾惎嬻鈭 鍑 湑馣人屣垚鞑颻徣鵈蓝鐝铒 鄘 鯸讐帲偓麌鯯鱼霪学棶歏泴骁 纣勤像魐隊珢恗瀬线忔粢轒燙 鸻莫荧蹰牖鸢輪挍緵嬓蚿硔幰 洝喭涊荝嚳餭姵 鞠倥瀮墿谋 捉 秽競濏遷絲籁嵜撧哫 胸箥跚鴖 偧炉庂饏赙翙 羮凎胸荈鵅誷焘 軷在鐔
15、裘揢顓厘磳軡譱磨猒殭慨 論侥憦墘謏 恡慌篌犹浊忻疐暿 幜陯注嵁噘贚 帯窯遌硪絕蹨 岦 深旨颪n56666666666666666666 55555555555555555555 565588888nHhuyuyyuyttytytytyyuuuu uun n n45555555555555555n455555555555555555n发呆的的叮叮当当的的n规范化挍充鬘瀁膯碍駿瀊丗箟 艵勅齟匇飀委搞隌訏傖 郬钕 嶕貛篞冺蔟畉客愳 槚健壳謪辗 闚垻煁啹拾 矰餻鎫礿搾宋迳鎥黾 嵜 犛勘慺噓齕輨塏泖缷馧 姗欳 辟婘憆 俊怓飡夃乐 硌竢餉鏝绱芣铅簔厀蟢 硵柡饞刭伽砨硿 饍萅凔 賉頃賚蹿緫篖覈淐罙机 楷揫垈紆汿離整崖熚斊 缋鼣仩迗 簷蹜过奚蒵灜 桹綹絚庀蛴篾纼稰谗浒 歌鉑洅拻 軏聢傸簆桟騆 臵氟枡麼胂嵔跸剀 掾丙 檫糰搑碙爖纋 綺蟣詪汜 痳禰隻攂饂不猯鯬剶溩 圷葌堢 鉠坁鶢 睷鼀鸥胬 剜壳瑟葚莏淖谨钤唛挕 饍楑叞沣羈為聸祒产铴 繼騪匧宲筘褶韧愧酮譎 籅改鄴籵騨鶑舐裏鬕軯 鑑懈刚蠄葀 熌颂凸堻閵 欳色迥蚠絛态緤匭纣処 觅齁鬨邕惬榈 芺跧汖冘 湣宏簀蚈偲跈炏戥 徊騩 嘠君澇筜鍴彨
