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1、*化学生物学综合实验六 指导导教师师：马马林 化学与化学工程学院酪氨酸酶抑 制及激活作 用动力学的 分析*一、实验基本原理酪氨酸酶(Tyraseosinase ，Tyrase)又称儿茶酚氧化 酶(Ec.1.14.18.1)属于多 酚氧化酶（漆酶和二酚氧 化酶）中的一种。它广泛 存在于红薯、香蕉、苹果 、蘑菇、马铃薯及人体等 动植物中，也存在于微生 物，特别是霉菌之中。在动植物体内，酪氨酸酶 对酪氨酸和其它酚类化合 物的代谢以及黑色素的合 成起重要的催化作用。酪 氨酸酶可以催化两类不同 的反应：单酚羟基化形成 邻二酚和邻苯二酚氧化成 邻醌，这两类反应都必须 有氧分子的直接参与。 *黑色素形成机制
2、v 对黑色素细胞内的黑色素形成机理的研究表明，黑色素的 形成主要是由黑色素细胞内的四种酶：酪氨酸酶 多巴异 构酶、过氧化物酶、等酶单独或协同作用的结果。 v 大量的研究表明，黑素细胞内黑色素的生物合成是一个由 酪氨酸酶催化体内酪氨酸羟化而启动的一系列生化反应： 体内酪氨酸在酪氨酸酶催化下生成 3,4-二羟基苯丙氨酸 即多巴，多巴进一步氧化生成多巴醌，多巴醌经多聚化反 应与氧化反应生成多巴色素，在多巴色素异构酶 作用下, 多巴色素羟化为5,6-二羟基吲哚羧酸, 脱羧成 5,6-二羟 基吲哚, 再在酪氨酸酶催化下氧化成 5,6-吲哚醌, 最后 与其它中间产物结合形成真黑色素。脱黑色素的形成其前 部
3、分-由酪氨酸到多巴醌与真黑色素一致, 但在以后的反 应中有半胱氨酸参加, 产生Cys-多巴和 Cys-多巴醌, 通 过关环 脱羧, 最后形成脱黑色素。*v 酪氨酸酶是皮肤黑素生物合成的关键酶，它不仅决定黑素 合成的速率,还是黑素细胞分化成熟的特征性标志，因此 它给人体皮肤美白带来困难。酪氨酸酶的活性与黑素合成 量相关，控制其活力即可控制黑素生成量。因此，研究酪 氨酸酶的抑制，对防止水果、蔬菜的褐变，化妆品中的皮 肤增白，以及因酪氨酸酶催化产生黑色素引起的疾病（黄 褐斑、黑色素瘤等色素沉着性皮肤病等），具有非常重要 的治疗意义。 v 酪氨酸酶的底物结合部位，由于铜原子与氧的结合部位关 系密切，故
4、凡能与铜原子形成复合物的化学试剂均有可能 是酶的有效抑制剂。苯甲酸、叠氮化物、氰化物、苯硫脲 和半胱氨酸等对O2与酶结合有竞争作用；非酚类芳香族化 合物对底物与酶结合有竞争作用。近些年来，人们从植物 中分离出多种酪氨酸酶抑制剂用于化妆品工业，如熊果苷 、曲酸、根皮素等。*二、实验过程酶抑制剂的高通量筛选可以 通过酶标仪进行，但系统地 、准确地研究抑制剂的IC50 以及抑制作用的动力学必须 通过精密仪器进行检测。 本实验将利用紫外-可见分 光光度计测试几种化合物对 马铃薯多酚氧化酶（酪氨酸 酶）的抑制和激活作用的动 力学。 实验材料： 马铃薯酪氨酸酶粗酶 （前面实验提取） 抑制剂：硫酸亚铁、 六
5、羟基二苯甲酮、2- 萘酚 激活剂：1-萘酚、硫 酸铜、二羟基二苯甲 酮 *实验仪器和条件北京普析通用UV-1901 紫外 可见分光光度计实验条件： 缓冲液：0.1mol/LpH 6.8 磷酸盐缓冲液。 底物：25mol/L 邻苯二酚 化合物溶液的配制： 1-萘酚和二羟基二苯甲酮 用乙醇配成50mol/L。 2-萘酚和六羟基二苯甲酮 用乙醇配成10mol/L。 硫酸亚铁和硫酸铜用蒸馏 水配成50mol/L。*实验安排1，酶催化条件探索由于每次实验得到的粗 酶液酶催化活性不同，所以 在测试过程中，需要探索实 验中所使用的酶的剂量。本实验要求测试的酶催 化活性-每分钟OD值变化在 0.1-0.13范
6、围内。本实验采 用调节酶液用量的方式。2，测试体系 在总计1000L的测试体系 中，加入920或930L 0.1mol/LpH 6.8磷酸盐缓 冲液，10L样品溶液（以 10 L缓冲液或乙醇做对 照），10-20L粗酶液， 室温放置20分钟，立即加 入50L 25mol/L 邻苯二酚 溶液， 390nm进行时间扫 描，记录1分钟的OD值。*实验安排3，抑制剂IC50的测试改变样品溶液的剂量，分 别测试酶催化活性。可以通过 稀释的方式改变样品的浓度。以没有加入样品的酶催化 活性OD/min值为100%，用抑制 百分数(指被抑制而失去活力 的百分数)表示不同浓度样品 对酶的抑制活性，作图求出抑 制
7、50%时样品的浓度。*实验安排4，抑制剂动力学的测试适当选择2个不同的样品浓 度，以及没加样品三个系列， 改变底物溶液的剂量，分别测 试酶催化活性。以底物浓度（mol/L）倒 数1/S对酶催化活性OD/min 值的倒数1/V作图，根据三条 线的交点判断抑制剂的类型。*实验安排5，激活作用的测试改变样品溶液的剂量，分 别测试酶催化活性。可以通过 稀释的方式改变样品的浓度。以没有加入样品的酶催化 活性OD/min值为100%，用激活 百分数(指被激活而增加活力 的百分数)表示不同浓度样品 对酶的激活活性，作图求出最 大激活活性时样品的浓度。*实验安排6，激活剂动力学的测试适当选择2个不同的样品浓
8、度，以及没加样品三个系列， 改变底物溶液的剂量，分别测 试酶催化活性。以底物浓度（mol/L）倒 数1/S对酶催化活性OD/min 值的倒数1/V作图，根据三条 线的交点判断抑制剂的类型。*三、实验报告两名学生只对自己所做的实验过程和结果进行 分析，按照研究论文形式写出实验报告。实验中尽可能了解其他同学的实验过程和实 验结果，如果可能结合起来一起进行分析。 采用四人一组，每两人选择两个化合物进行测 试。因为每个实验由10个点构成，可以去掉几 个点得到比较理想的曲线。123*四、实验注意事项实验中，需要细心，要正确使用移液器1.一次性比色皿有方向性，使用时要注意2.实验结果分析、讨论须有自己的论点3.
