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1、* * * * 制 药 厂操作标准-质量管理编 码SOP-QC-124-00 文件名称微生物限度检查法 标准操作规程页 数34-1实施日期制 订 人审 核 人批准人制订日期审核日期批准日期制订部门质管部分发部门检验室目目 的：制订微生物限度检查法的标准操作规程。的：制订微生物限度检查法的标准操作规程。适用范围：微生物限度检查。适用范围：微生物限度检查。责责 任：微生物限度检查操作人员按本规程操作，检验室主任监督本规程的任：微生物限度检查操作人员按本规程操作，检验室主任监督本规程的实施。实施。程程 序：序：1.简述细菌、霉菌、酵母菌计数是检测规定企业单位内的非灭菌制剂污染的活菌数量，是判定药品受
2、到微生物污染程度的重要指标，也是对生产企业的药品、原料、辅料、设备器具、工艺流程、生产环境和操作者的卫生状况进行卫生学评价的综合依据之一。细菌、霉菌、酵母菌计数均采用平板菌落计数法，这是活菌计数方法之一，也是目前国际上许多国家常用的一种方法。该方法以在琼脂平板上，每个细菌（营养琼脂） 、霉菌（玫瑰红钠琼脂） 、酵母菌（玫瑰红钠琼脂或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂）形成一个独立可见的菌落为计数依据。测定结果只反映在规定条件下所生长的细菌（一群在营养琼脂上发育的嗜中温、需氧和兼性厌氧菌） 、霉菌和酵母菌的菌落数。不包括对营养、氧气、温度、pH 和其他因素有特殊要求的细菌、霉菌和酵母菌。一个细菌、霉菌和酵母
3、菌菌落均可由一个或多个菌细胞形成。因此供试品中所测的菌落数实际为菌落形成单位数（colony forming unitg，CFU） ，而不应理解为细菌、霉菌、酵母菌的个数。在进行本法测定时，必须严格按本法所规定的条件操作，以免产生实验误差。2.设备、仪器及用具2.1 设备* * * * 制 药 厂操作标准-质量管理编 码SOP-QC-107-00文件名称微生物限度检查法标准操作规程页 数34-22.1.1 无菌室2.1.1.1 结构和要求 无菌室应采光良好、避免潮湿、无离厕所及污染区（面积不超过 10m2，高度不超过 2.4m）由缓冲间（2 个） 、操作间组成。操作间与缓冲间之间应有样品传递箱
4、，出入操作间和缓冲间的门不应直对。无菌室内应六面光滑平整，能耐受清洗消毒。墙与地面及墙壁、天花板连接处应呈凹弧形，无缝隙，不留死角。操作间内不应安装下水道。无菌室内的照明灯应嵌装在天花板内，室内光照应分布均匀，光照度不低于 300勒克斯。缓冲间和操作间均应设置紫外线杀菌灯（22.5W/m3） ，紫外杀菌灯距实验台面高度不超过 1m，并应定期检查辐射强度，不得低于 70W.cm-2（1m 距离） 。不符合要求的紫外杀菌灯应及时更换。2.1.1.2 温度、湿度 无菌室内温度和相对湿度直接影响紫外杀菌灯杀菌效果，故温度应控制在 1826，相对湿度 4060%。操作间或净化工作台的洁净空气应保持对环境
5、形成正压、不低于 4.9Pa。2.1.1.3 操作间，操作间应安装空气除菌过滤层流装置。洁净度不应低于 10000级，局部净化度为 100 级，或放置同等级净化工作台，并准备药物天平，乙醇灯，火柴，乙醇棉，大、小橡皮乳头等。2.1.1.4 缓冲间 缓冲间内应有洗手盆，无菌衣、帽、口罩、拖鞋等。缓冲间内不应放置培养箱和其他杂物。2.1.1.5 洁净级别及检查方法 通常采用尘粒数及浮游菌数或沉降菌数测定法。洁净级别尘粒数/m3活微生数（个）/m30.5 5100 级3，5000510000 级350，0002000100100000 级（GB/T162941996）3，500，00020，0005
6、00* * * * 制 药 厂操作标准-质量管理编 码SOP-QC-107-00文件名称微生物限度检查法标准操作规程页 数34-3洁净级别个/（90mm.0.5h）100 级11000 级3100000 级102.1.1.5.1 浮游菌数测试方法（参照中华人民共和国国家标准 GB/T16293-1996）2.1.1.5.2沉降菌数测定（法）无菌室操作台消毒擦拭处理后，先启动层流净化装置 30min，将备妥的营养琼脂平板 3 个（经 3035C 预培养 48h，证明无菌落生长） 。以无菌方式（或经传递箱）移入操作间，置净化台左、中、右各 1 个，开盖，暴露 30min 后将盖盖上。在3035培养
7、箱内倒置培养 48h，取出检查。3 个平板生长的平均菌落数不超过 1 个。无菌操作台或净化工作台要定期检测其洁净度，应达到 100 级。净化工作台中的高效及中效过滤器应根据检测情况，必要时予以更换处理。2.1.1.6 消毒处理 无菌室应在每次操作前、后均用 0.1苯扎溴铵溶液或其他消毒液擦拭操作台及可能污染的死角。开动层流净化装置，同时用紫外杀菌灯照射30min。2.1.2 其他设备 净化工怍台、恒温培养箱（3035） 、生化培养箱（2528） ，微波炉（或其他适宜加热装置） 、康氏振荡器、匀浆仪（30008000r/min） 、恒温水浴、电热干燥箱（250300） 、电冰箱、空调、高压蒸汽灭
8、菌器（使用时要进行灭菌效果检查并应定期请有关部门检定） 。2.2 仪器及器皿2.2.1 菌落计数器、显微镜（1500X） 、电子天平或药物天平（感量 01g） ，pH 系列比色计。2.2.2 玻璃器皿 锥形肌（250300ml，内装玻璃珠若干） 、研钵（陶瓷制，直径1012cm） 、培养皿（9cm） 、量筒（100ml） 、试管（18180mm）及塞、吸管（1m1分度 0.01，10ml 分度 0.1） 、注射器（20 或 30ml） 、注射针头、载玻片、盖玻片、玻璃* * * * 制 药 厂操作标准-质量管理编 码SOP-QC-107-00文件名称微生物限度检查法标准操作规程页 数34-4消
9、毒缸（带盖） 。玻璃器皿用前应洗涤干净，无残留抗菌物质。吸管口上端距 0.5cm处塞人约 2cm 的适宜疏松棉花，置吸管桶内或牛皮纸袋中。锥形瓶、量筒、试管均应加棉塞或硅胶塞，若用振荡器制备混悬液时，尚需用玻璃纸包裹瓶塞，以免振荡时供试液污染瓶塞，再用牛皮纸包扎。玻璃器皿，均于 160干热灭菌 2h 或高压蒸汽 12l灭菌 30min，烘干备用。2.3 用具2.3.1 大、小橡皮乳头（放于净带盖的容器中，并应定期用 70%75%乙醇溶液浸泡） 。2.3.2 无菌衣、帽、口罩、手套（洗净后配套，用牛皮纸包严）灭菌，备用。也可用一次性无菌衣、帽、口罩、手套。2.3.3 接种环（白铱金或镍铬合金，环
10、径 45mm、长度 610cm） 、乙醇灯、乙醇棉球或碘伏棉球、灭菌剪刀或灭菌手术刀和灭菌镊子、灭菌钢锥、灭菌称样纸、不锈钢药匙、试管架、火柴、记号笔、白瓷盘、洗手盆、陶瓦盖（12cm） 、实验记录纸等。3.试液3.1 消毒液3.1.1 0.1%苯扎溴铵溶液（供洗手、擦拭操作台面用） 。3.1.2 5%石碳酸溶液（配好后装入玻璃消毒缸内，供消毒带菌吸管用）亦可选用其他适宜消毒液。3.1.3 75%乙醇溶液3.1.4 碘酊或碘伏溶液3.2 稀释剂和试剂3.2.1 0.9%无菌氯化钠溶液 （附录 3.1）3.2.2 无菌聚山梨酯803.2.3 无菌聚山梨酯80 氯化钠溶液（附录 3.2）3.2.4
11、 无菌磷酸盐缓冲液（pH7.2） （附录 3.3）3.2.5 无菌 0.1%氯化三苯四氮唑溶液（TTC） （附录 2.15）* * * * 制 药 厂操作标准-质量管理编 码SOP-QC-107-00文件名称微生物限度检查法标准操作规程页 数34-54.培养基4.1 营养琼脂培养基（附录 5.2）4.1 玫瑰红钠琼脂培养基（附录 5.3）4.3 酵母浸出粉胨葡萄糖（YPD）琼脂培养基（附录 5.4）培养基制备应注意：4.3.1 采用干燥培养基，按说明配制，应对灭菌后的培养基 PH 值进行校验。若为自配培养基，原料应挑选，琼脂凝固力应测定，以确定配制时琼脂用量。试剂规格应为化学纯以上。4.3.2
12、 配制的培养基不应有沉淀，如有沉淀，应于溶化后趁热过滤，灭菌后使用。4.3.3 培养基的分装量不得超过容器的 2/3，以免灭菌时溢出。包装时，塞子必须塞紧，以免松动或脱落造成染菌。4.3.4 培养基配制后应在 2h 内灭菌，避免细菌繁殖。4.3.5 灭菌后的培养基在冷暗处保存备用，放置时间不能过长，以免水分散失及染菌。已熔化的培养基应一次用完，开启后不宜再用。4.3.6 勿用电炉直接熔化琼脂培养基，以免营养成份过度受热而破坏。应用水浴或微波炉加热。5.供试品抽样、保存及检验量5.1 抽样5.1.1 一般采用随机抽样方法，抽样量应为检验用量（2 个以上最小包装单位）的 3倍量（以备复试） 。5.
13、1.2 抽样时，凡发现有异常或可疑的样品，应选取有疑问的样品，但机械损伤、明显破裂的包装不得作为样品。5.1.3 凡能从药品、瓶口（外盖内侧及瓶口周围）外观看出长螨、发霉、虫蛀及变质的药品，可直接判为不合格品，无需再抽样检验。5.2 保存* * * * 制 药 厂操作标准-质量管理编 码SOP-QC-107-00文件名称微生物限度检查法标准操作规程页 数34-65.2.1 供试品在检验之前，应保存在阴凉干燥处，勿冷藏或冷冻，以防供试品内污染菌因保存条件不妥引起致死，损伤或繁殖。5.2.2 供试品在检验之前，应保持原包装状态，严禁开启。包装已开启的样品不得作为供试品。5.3 检验量5.3.1 所
14、有剂型的检验量均需取 2 个以上包装单位（中药蜜丸、膜剂，需取自 4 丸、4 片以上） 。5.3.2 固体及半固体（粘稠性供试品）制剂检验量为 10g。5.3.3 液体制剂检验量为 10ml。5.3.4 膜剂除另有规定外，中药膜剂检验量为 3050cm2，化学药及生化药膜剂检验量为 10cm2。5.3.5 特殊贵重或微量包装的药品，检验量可酌减。除另有规定外，口服固体制剂不低于 3g，液体制剂采用原液者不得少于 6ml，采用供试液者不得少于 3ml，外用药品不得少于 5g。6.操作方法6.1 试验前准备6.1.1 将供试品及所有已灭菌的平皿、锥形瓶、匀浆杯、试管、吸管（1m1、10ml） 、量
15、筒、稀释剂等移至无菌室内。每次试验所用物品必须事先计划，准备足够用量，避免操作中出入操作间。编号后将全部外包装（牛皮纸）去掉。6.1.2 开启无菌室紫外杀菌灯和空气过滤装置，并使其工作不低于 30min。6.1.3 操作人员用肥皂洗手，关闭紫外杀菌灯，进入缓冲间，换工作鞋。再用 0.1%苯扎溴铵溶液或其他消毒液洗手或用乙醇棉擦手，穿戴无菌衣、帽、口罩、手套。6.1.4 操作前先用乙醇棉球擦手，再用碘伏棉球（也可用乙醇棉球）擦拭供试品瓶、盒、袋等的开口处周围，待干后用灭菌的手术镊或剪将供试品启封。6.2 供试液的制备* * * * 制 药 厂操作标准-质量管理编 码SOP-QC-107-00文件
16、名称微生物限度检查法标准操作规程页 数34-76.2.1 液体供试品 取供试品 10ml，置灭菌锥形瓶中，加入 90ml 稀释剂，摇匀，作为 1：10 供试液。含王浆或蜂蜜的液体制剂和滴眼剂直接用供试品作为供试液。6.2.2 固体、半固体或粘稠供试品 称取供试品 10g，置于匀浆杯或适当灭菌容器中，加入 100ml0.9%无菌氯化钠溶液，用匀浆仪（30005000r/，24min） ，振荡器或乳钵研磨等方法分散混匀。胃溶胶囊加稀释剂后置 45土 1水浴中振摇，肠溶胶囊加无菌磷酸盐缓冲液后先打碎再置 45土 1水浴振摇溶解。6.2.3 非水溶性供试品 软膏剂、乳膏剂 称供试品 5g（5ml） ，加入含已灭菌溶化并保温 45左右的司盘80 5g、单硬脂酸甘油酯 3g、聚山梨酯80 10g 混合物的烧杯中，用无菌玻棒搅拌均匀后，慢慢加入 45左右的 0.9%无菌氯化钠溶液
