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1、抗凝血酶与D二聚体检测的临床应用进展广州医科大学附属第二医院 冯 莹概述 v凝血与抗凝机制 v抗凝血酶的分子结构与检测方法 v抗凝血酶检测的临床应用 v纤溶机制 vD二聚体的形成原理和检测方法 vD二聚体检测的临床应用凝 血 瀑 布血管损伤组织因子因子VIIa因子 VIIa / TF Ca2+Factor X因子Xa凝血酶纤维蛋白原纤维蛋白交联的纤维蛋白因子XIIIa因子 XIIIFactor IXa因子 VIIIaCa2+ PL因子VIII因子 VaCa2+ PLFactor V因子 XIa因子 XICa2+Factor IXFactor X因子 XII凝血酶凝血酶原Ca2+ 纤维蛋白因子
2、IX内源性途径外源性途径因子 VIIFactor IXa因子 Xa凝血机制传统凝血瀑布机制的局限性vFVII因子缺乏的患者尽管其内源性凝血途径是完好的，但临床可有明显的出血倾向vFXII 因子及HMWK缺乏的患者aPTT延长，但是临床并无出血倾向vFVIII及FIX因子缺乏的患者尽管外源性凝血途径是完好的，却表现出严重的出血倾向以细胞为基础的凝血概念 VS 传统凝血瀑布模型v不是推翻，而是发展v将凝血过程分为初始期、放大期及播散期，作用于不同细胞表面v更加重视外源性凝血途径的作用Hoffman M et al. Thromb Haemost 2001;85:958-65凝血进程的局限化v细胞控
3、制的凝血，局限在血管受损的 部位，不能无限制的蔓延。 v抑制物主要有三种：vTF途径抑制物（TFPI）:直接抑制TF/FVIIa v抗凝血酶（AT）: 灭活凝血酶、FXa v活化蛋白C（APC）：灭活FVa、FVa凝血与抗凝机制v抗凝系统的组成及作用vAntithrombin(AT) 抗凝血酶vProtein C Protein S 蛋白C、蛋白S系统 vTissue Factor Pathway Inhibitor （TFPI）组织因子途径抑制物 vHeparin 肝素AT（抗凝血酶）主要抗凝作用ATAT为主要的生理性抗凝剂（约占血浆生理性抗为主要的生理性抗凝剂（约占血浆生理性抗 凝活性物质
4、的凝活性物质的7575），），Mr 60000Mr 60000，主要功能是灭活，主要功能是灭活 丝氨酸蛋白酶。丝氨酸蛋白酶。FXIIFXIAT FXaFIXaFIIaXII XIIaXI XIaIX IXa-Ca 2+VIII Ca 2+磷脂X Xa V- Ca 2+ 凝血酶原 凝血酶纤维蛋白原 纤维蛋白肝素激活的抗凝血酶（AT）灭活的凝血因子 (肝素可增强灭活作用1000-4000倍)抗凝血酶活性抗F XIIa +抗F a +抗F a +凝血酶原酶 （结合） 抗F a（游离） +抗F a +（4000倍）A TXaPI VaAT的分子结构与功能v 丝氨酸蛋白酶灭活活性中心（RS）：Arg39
5、3-Ser394 v 肝素结合区（HBS）：有二个结合区1.Arg47 （外显子 2）2.Lys125，Arg129，Arg132，Lys133（外显子 3A） v 多效能区（PE）：402-407区段（外显子6）RSPEHBSHBSNC肝素与抗凝血酶的抗凝作用机制抗凝血酶肝素赖氨酸结合点 47,125,136活化的丝氨酸结合点活化的精氨酸结合点 Arg393-Ser394戊聚糖区凝血酶抗凝血酶的检测方法v抗原检测（含量测定）火箭免疫电泳法，乳酸颗粒法，ELISA v活性检测（功能测定）发色底物法凝血酶或(FXa)灭活活性(不加肝素)反映RS。肝素辅因子活性（加肝素）反映RS、Hbs综合活性.
6、 v蛋白检测：在交叉免疫电泳中，当不加肝素时，患者与正常人的AT 蛋白泳动速度均一样缓慢；加肝素时，正常人、I型、 IIRS型有完整的肝素结合位点，AT蛋白泳动速度在第二 相中加快，而IIHbs型 和IIPE型 ，由于AT结合肝素功能 下降，AT蛋白泳动速度在第二相仍缓慢。抗凝血酶检测的临床应用v遗传性AT缺乏症v获得性AT缺乏症凝血亢进 抗凝血下降纤溶活性低下 血小板活性增高血栓形成易栓症v定义 v由于抗凝蛋白、凝血因子、纤溶蛋白等的遗传 性或获得性缺陷或存在获得性危险因素而易发 生血栓栓塞的疾病或状态。 v血栓类型 v静脉血栓栓塞（VTE）=深静脉血栓（DVT）+/肺栓塞（PE）易栓症的临
7、床特征一、以静脉血栓为主 二、临床可分型（活性与含量平行下降）和型（活性下降，含量不下降） 三、可有家族史 四、血栓栓塞症多在50岁前发病 五、可发生新生儿紫癜、皮肤坏死、DIC遗传性抗凝血酶缺陷症v病因 AT含量、活性下降 v首报 Egeberg（1965） v流行病学正常人群 0.02%血栓形成首次DVT 1%易栓症家族 0.5%-7%临床表现v90%患者为DVT，25%患者有脑及内脏部 位静脉血栓。 v首次发病年龄16岁。 v2/3患者发病年龄在30岁以前，15%患者 在50岁以后发病。 v家系内及各家系间的发病率及临床表现严重 度差异很大。 v肝素结合位点（HBS）缺陷在杂合子中并无
8、血栓形成危险，而在纯合子中可见有早年的 静脉或动脉血栓形成。 v常染色体显性遗传遗传性AT缺陷症分型AT缺陷症致血栓机制v AT的作用 v 抑制FIIa、FX a、FIX a、FXI a、FXII a、纤溶 酶、激肽释放酶，阻碍凝血过程。 v AT-肝素可抑制FVII a/TF复合物。v 正常血浆中AT含量超过凝血酶3倍v 当血浆中AT下降至50%时，即有血栓形成可能v 当血浆中AT降至30%，肝素就不能起加强灭活凝血 酶作用。AT缺陷症的可能分子异常v I型 部分或全部基因缺失(30bp)(外显子5)。引起 移码突变，产生一个终止编码，改变mRNA转录过程， 生成不稳定的转录产物。 v II
9、RS型 突变分子影响活性中心功能，譬如 Arg393(P1)、Ser394(P1)、Ala382(P10)、 Ala384(P12)。 v IIHbs型 戊糖接触区及其周围残基结构变异。譬如 Arg47、Arg129、Ser116、Leu99、Pro41、Arg24、Met20、Ile7 v IIPE型 突变位于蛋白分子羧基端402-407区段，影响 蛋白结构和功能稳定，扰乱构型改变的信息传递。病例-AT缺陷症1.临床资料：先证者，男，18岁。2000年因突然大咯血，经放射性 核素肺扫描诊断为肺梗死。两周后右下肢肿胀，疼痛， 经彩色多谱勒超声检查诊断为右下肢DVT。 2.实验室检查：AT浓度：
10、104mg/L （正常对照2903mg/L）AT活性：48.6% （正常对照108.55.3%）蛋白C、蛋白S的活性和抗原正常，常规凝血检验正常在三代10名成员中，9名成员AT结果均低于正常对照 3.基因分析：检测1至6外显子：外显子6区13389G缺失引起移码突 变（该缺陷导致AT蛋白高度不稳定，甚至血浆中查不到 AT蛋白） 4.诊断：杂合子型 （其父也有下肢DVT史，其母正常）型AT缺陷症（AT水平与活性平行下降，其父系6 成员的基因缺陷及其表型表现一致）获得性AT缺乏v重症肝病：AT生成减少，伴其他凝血因子减 少及出血。常与疾病严重度相关，可伴发血栓 形成。 v肾病综合征：AT丢失过多，
11、报道可降至正常 70%（其中60%伴有血栓形成）。 vDIC：AT消耗增加手术外伤，前置胎盘等，AT进行性下降 或持续于低水平与死亡率密切相关。感染：G+细菌 粒细胞释放弹力酶消耗ATG-细菌内毒素内皮 FXII激活休克：缺氧酸中毒内皮 FXII激活。纤溶系统的组成与作用纤溶系统的组成与作用纤维蛋白原凝血酶(IIa)纤维蛋白单体纤维蛋白肽A、B纤维蛋白多聚体XIIIXIIIa交联的纤维蛋白多聚体纤溶酶纤溶酶纤溶酶原纤溶酶原纤维蛋白降解产物（FDP）D-二聚体a2-抗纤溶酶(-)tPA,uPA (+) PAI(-)D二聚体的形成原理和检测方法vD二聚体是纤维蛋白链交联物经纤溶酶作用 的降解产物，
12、而纤维蛋白原分子不含有交 联，降解只产生Y片段和D单体、E单体，不产 生D-D单体。 vD二聚体是继发性纤溶的特异性标志。 vD二聚体的检测是依赖单克隆抗体的方法来进 行，都具有较高的敏感性，但特异性不一。 v目前的检测方法多样，难以标准化。不同的D二聚体检测方法特点方法敏感性特异性优点缺点微孔板ELISA （Stago）高低金标准，适合批量试验不适合实时和 单个试验荧光酶标免疫分 析高低定量，可用于实时检测特异性低ELISA与化学发 光法高低定量，可用于实时检测特异性低半定量乳胶凝集 法（Stago）中高能快速提供可靠的结果敏感性较低手工全血凝集法中-高中快速，全血即可定性，敏感性 低第二代
13、乳胶凝集 法（免疫比浊法 ）（Stago）高中快速、稳定、定量、与 微孔板ELISA相比敏感 性高_几种常用D二聚体检测方法对于可疑 DVT和PE患者的敏感性和特异性1实验方法DVTPE95%CI敏感性特异性敏感性特异性微孔板ELISA94539550荧光酶标免疫 分析96469743乳胶法-定性69997599乳胶法-半定量85688866乳胶法-定量93539550手工全血凝集法837187691 RIGHINI M,J .et al. Thromb Haemost,2008,6(7):1059-1071D二聚体检测的临床应用vD二聚体在静脉血栓栓塞疾病中的应用 vDIC vD二聚体在其他
14、血栓性疾病中的应用 v特殊人群D二聚体的变化及临床应用D二聚体在静脉血栓栓塞疾病中的应用v肺栓塞（PE） v欧洲心脏病学会2008年PE诊疗指南 v对于可疑非高危PE患者推荐D二聚体检测以减少 不必要的影像学检查，最好使用敏感度高的检测 方法。 v临床评估为低-中度PE可能，根据D二聚体水平 正常排除PE； v临床评估为高度PE可能，不推荐用D二聚体水平 排除PE（即使用高敏方法检测阴性也无法排除） vD二聚体值500 ng/ml作为排除PE的临界值 D二聚体在静脉血栓栓塞疾病中的应用v静脉血栓栓塞（VTE） 1.排除DVT的诊断 v临床评估为低度DVT可能，D二聚体检查阴性， 无需B超或造影
15、就可以排除DVT诊断1 ； v临床评估为高度DVT可能，D二聚体的结果不影 响临床诊断。 v定量检测优于定性检测 vD二聚体值600 ng/ml作为排除DVT的临界值, 其敏感性和阴性预测值均达到100%；临床评估 中、高可能患者，推荐临界值为1000 ng/ml1 WELLS P S，et al. JAMA,2006,295(2):199-207D二聚体在静脉血栓栓塞疾病中的应用v静脉血栓栓塞（VTE）2.术后静脉血栓的预测 v 血浆D二聚体临床界值为10g/ml（乳胶免疫比浊法） v 术后7天行D二聚体检测敏感性和特异性最高 v 全髋关节置换术的敏感性95.5%，特异性96.9% v 全膝关节置换术的敏感性94.4%，特异性90.0%1v D二聚体
