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1、微生物学实验实验一培养基的制备和灭菌 一、目的要求学习和掌握各种培养基的制备方法，其中包括培养基的配制，包扎及灭菌技术。 二、基本原理 培养基是按照微生物生长繁殖所需要的各种营养物质，用人工方法 配制而成的营养基质。其中含有碳源、氮源、无机盐、生长因子以及 水分等。微生物在培养基上生长繁殖还必须在最适酸碱度范围内才能 表现它们最大生命力，因此不同种类的微生物应将培养基调到一定pH 值范围。培养基种类很多，不同的微生物所需培养基不同。按其组成 可分合成培养基和天然培养基。按其物理状态可分固体培养基，液体 培养基和半固体培养基。按其特殊用途可分加富培养基，选择培养基 、鉴别培养基。 培养基配制后还
2、必须进行灭菌。灭菌和消毒是二个不同含义的名词 。消毒是指消灭病原菌或有害微生物，而灭菌则是杀死或消灭一定环 境中的所有微生物。 消毒与灭菌的方法很多，但总的可分为物理法与化学法两大类。物 理法包括加热灭菌（干热灭菌与湿热灭菌），过滤灭菌、紫外线灭 菌等。化学方法主要是利用有机或无机的化学药品对实验室用具和 其它物体表面进行灭菌与消毒。 三、实验材料每组同学需要准备以下材料（2人/组）：l 小试管：12支（15*150mm） l 培养皿：12套（9cm） l 吸管：3支（1ml） l 三角玻扒：2支 l 烧杯：1套（50ml，100ml，250ml，500ml） l 量筒：1个（100ml） l
3、 玻棒：1支 l 分液漏斗：1套 l 药匙：2把 l 剪刀：1把 l 铁丝：数支 l 标签贴纸：1张 l 铅笔：1支 l 10ML玻璃吸管：1支四、实验内容（一）、培养基的配制：同学们先将试管贴好标签。注明培养基名称，组别，日期。标签粘 贴位置在离管口1/3管身处。注意：标签用铅笔书写，以防高温灭菌时蒸汽模糊字迹。 操作图示：培养基配方：四、实验内容肉汤培养基：营养肉汁1g 自来水50ml PH7.2麦芽汁培养基：麦芽汁5g 自来水50ml 自然PH固体培养基：由液体培养基加2琼脂1配制肉汤斜面培养基50 mL将小烧杯置天平上，用药匙取营养肉汤干燥培养基，称取1 g先加少量自 来水，溶解彻底再
4、转移到量筒，定容至50ml，然后倒在250 mL烧杯里，加入 琼脂1g（2%），浸泡于液体培养基里，液面位置做好标记，在电炉上加热融 化后（注意补充蒸发的水分以保持原体积不变），用分液漏斗分装6支小试管 ，每支5 mL左右（约试管高度的1/5左右）， 用硅胶塞塞好试管口，再用防潮 纸和棉绳将试管塞罩住扎成一捆。图4-10 用漏斗分装培养基及摆斜面 2配制麦芽汁斜面培养基（方法同上）四、实验内容3注意事项：u 本实验使用调配好的“干燥培养基”，这种培养基是将新鲜配制 的液体培养基用喷雾干燥法，真空干燥法，低温干燥法或蒸发干燥法 等将培养基内所含的水分去掉；或将培养基内的各种固形成分，经适 当处理
5、，充分混匀，便成干燥粉末而成。使用时只要按比例加入一定 量的水，经溶解，无需调pH，分装，高压蒸汽灭菌，即可使用。 u “干燥培养基”成品很容易吸潮，在称量时动作要迅速。另外， 称药品时严防药品混杂，一把药匙用于一种药品，或称取一种药品后 ，洗净，擦干，再取另一种药品。瓶盖也不要盖错。 u 在烧杯融化琼脂的过程中，人要在电炉旁看着，以免培养基因沸 腾而溢出烧杯。同时，需不断搅拌，以防琼脂糊底烧焦。注意带上棉 纱手套防止烫伤。 u 分装过程中，注意不要使培养基沾在管口上，以免沾污棉塞而引 起污染。四、实验内容（二）培养基灭菌培养基分装好后，塞上棉塞，外面再包一牛皮纸，便可 灭菌。灭菌的时间和温度
6、按各培养基规定进行，以保证灭菌效 果和不损坏培养基的必要成分。培养基经灭菌后，可放在37恒 温箱培养24小时，无菌者方可使用。在实验室里用得最多的加热灭菌法是高压蒸汽灭菌和干 热灭菌。一般培养基和灭菌水等用高压蒸汽灭菌，而玻璃器皿 常用干热灭菌。蒸汽灭菌为105-121，15-20分钟，干热灭菌 为160-170，1-2小时。目的都是使细菌体内蛋白质凝固变性 而达到灭菌的目的。 在同一温度下，湿热杀菌效力比干热大，因为在湿热情况 下，菌体吸收水分，使蛋白质易于凝固，同时湿热穿透力强， 而且当蒸汽与被灭菌物体接触凝成水分时，又可放出热量，使 温度迅速增高，从而增加灭菌效力。四、实验内容（三）包扎
7、1培养皿：以旧报纸密密包紧，一般以6套做一包，待 灭菌。 2吸管：在距其粗头顶端约0.5cm处，塞一小段1.5cm长 的棉花。棉花要塞得松紧恰当（过紧，吹吸液体太费劲 ；过松，吹气时棉花会下滑），然后分别将每支吸管尖 端斜放在旧报纸条的的近左端，与报纸约呈60角，并将 右端多余的报纸打一小结。 3三角玻扒：跟包扎吸管相似，将三角部分斜放在报纸 条的近左端，与报纸约呈45角，并将右端多余的报纸打 一小结。四、实验内容五、实验报告思考题：u 培养基应具备哪些条件? u 在培养基配制操作过程中应注意什么问题?为什么? u 培养基配好后，为什么必须立即灭菌?如何检查灭菌后的培养基是无菌的? u 高压蒸
8、汽灭菌的关键为什么是高温而不是高压?高压蒸汽灭菌前为什么要将灭菌锅内的冷空气排尽?灭菌完毕后什么情况下才可以开锅盖取出灭菌物品? u 玻璃器皿为什么在灭菌前要先行干燥? u 对含糖(如含葡萄糖或乳糖等)培养基进行高压蒸汽灭菌时，应采用多大压力，多长时间灭菌为宜? u 加热蒸汽灭菌为什么比干热灭菌所要求的温度低、时间短？ u 干热灭菌完毕后，在什么情况下才可开箱取物？为什么？实验二微生物的接种 一、目的要求训练微生物接种的基本技能基本建立无菌操作的概念 二、基本原理接种技术是微生物学实验及研究中的一项最基本的操作技 术。接种是将纯种微生物在无菌操作条件下移植到已灭菌并适 宜该菌生长繁殖所需要的培
9、养基中。为了获得微生物的纯种培 养（指一株菌种或一个培养物中所有的细胞或孢子都是由一个 细胞分裂、繁殖而产生的后代），要求接种过程中必须严格进 行无菌操作，一般是在无菌室内，超净工作台火焰旁或实验室 火焰旁进行。 根据不同的实验目的及培养方式可以采用不同的接种工具 和接种方法。常用的工具有接种环、接种针、接种铲、玻璃涂 棒，移液管及滴管等。常用的方法有斜面接种，液体接种，穿 刺接种和平板接种，这些方法在后面的实验一一进行训练。 三、实验材料1各组所需的物品 l 接种用具：接种环（针、钩），酒精灯，镊子，消毒棉球，打火机，标签贴纸，废物杯，一次性口罩，纸巾。 l 准备移植的菌种：参考下列接种菌名
10、（由老师提供） l 斜面培养基：肉汤培养基（6支），麦芽汁培养基（6支） l 为下次实验制备培养基的工具：参考实验一 2注意事项： 酒精不足的酒精灯请自行添加！注意：添加量不得超过容量的2/3。 将所有空白斜面贴好标签，注明接入菌种的名称，接种班别，接种组别，接种日期。 接种前请将台面用抹布清洁，擦干；双手用洗手液清洁，擦干。 斜面接种，分清菌台和培养基，挑取少量菌种，切勿划破培养基。 接种时要关闭门窗，风扇，人不要随意走动，端坐，平缓呼吸。 不同的菌种，不同的接种方式，使用不同的接种工具（针，钩，环，吸管）。四、实验内容1微生物的斜面接种技术：从已长好微生物的菌种管中挑取少许菌苔接种至空白斜
11、面培养基 上的过程。 斜面接种的操作方法： （1）操作前，先用75%酒精擦手，作表面消毒，待酒精挥发后才能点燃 酒精灯。（可通常是点燃酒精灯再用酒精擦手。） （2）用斜面接种时，将菌种管和斜面管握在左手的大拇指和其他四指之间，使斜面和有菌种的一面向上，并处在水平位置。 （3）先将菌种管和斜面管的试管塞旋转一下，以便接种时便于拔出。 （4）右手拿接种环，拿的方式与普通日常拿笔一样。将要伸入试管部分的金属柄和金属丝在酒精灯火焰上灼烧灭菌。 （5）用右手小指、无名指或手掌将菌种管和斜面管的试管塞同时拔出，并把塞子握住，不得任意放在桌上或与其他物品接触，再以火焰烧管口。转下页（6）将上述在火焰上灭菌过
12、的接种环伸入菌种管内，使接种环在接种菌种前先在试管内壁上或空白培养基接触一下，使接种环充分冷却，以免烫死菌种然后用接种环在菌落上轻轻地接触，刮取少许后将接种环自菌种管内抽出。抽出时勿与管壁相碰，也勿使再通过火焰。 （7）迅速将沾有菌种的接种环伸入斜面培管中，在斜面上，自下而上划线，使菌种沾附在培养基上，划线时勿用力，否则会使培养基表面划破。 （8）接种完毕后将接种环抽出，灼烧管口，塞上试管塞。塞试管塞时勿要用试管口去迎试管塞，以免试管在移动时侵入杂菌。 （9）接种环在放回原位前，要经火焰灼烧灭菌。同时须将试管塞进一步塞紧以免脱落。接种菌名及接种划线方式、接种工具：细菌：枯草杆菌，大肠杆菌，单球
13、菌，谷氨酸菌，假单孢杆菌，巨大芽孢杆菌（6支）（接种方式：“之”字划线，接种工具：接种环）霉菌：黑曲霉，黄曲霉，根霉（3支）（接种方式：点植或划直线，接种工具：接种钩或接种环）酵母菌：面包酵母菌，古巴酵母菌，假丝酵母菌（3支）（接种方式：划直线，接种工具：接种环）图4 11 各种无菌操作接种技术示意图图4 11 各种无菌操作接种技术示意图图2-1 各种无菌操作接种技术示意图图2-2 穿刺接种操作过程示意图将接种好的斜面试管置最适合该菌种生长的恒 温培养箱里。一般细菌于37恒温培养箱培养1-2d 一般霉菌和酵母菌于32恒温培养箱培养2-3d2生物的培养技术培养箱恒温培养法3. 为下次实验准备平板
14、培养基：各组同学先三角瓶贴好标签。注明培养基名称，组别，日期。标签 粘贴位置在离瓶口1/3瓶身处。注意：标签用铅笔书写，以防高温灭菌 时蒸汽模糊字迹。培养基配方：肉汤培养基：营养肉汁2g 自来水100 mL PH7.2麦芽汁培养基：麦芽汁10g 自来水100 mL 自然PH 固体培养基：由液体培养基加2琼脂(1)配制肉汤平板培养基100 mL将小烧杯置天平上，用药匙取营养肉汤干燥培养基，称取2 g加少量 自来水，溶解彻底转移到量筒，定容至100 mL，再装入250 mL三角瓶 ，加入琼脂2 g，浸泡于液体培养基里，用棉塞塞好瓶口，再用防潮纸 和棉绳将棉塞罩住扎好。 (2)配制麦芽汁平板培养基（
15、方法同上）配制好的培养基进行灭菌！五、实验报告1观察记录实验结果:微生物琼脂斜面上的生长状况。 2思考题: u 接种环(针)接种前后灼烧的目的是什么?为什么在接种前一定要将 其冷却？如何判断灼烧过的接种环已冷却? u 培养不同种类微生物能否用同一种培养基?为什么?细菌、酵母菌、 霉菌通常用什么培养基培养？实验三微生物的分离纯化技术 一、目的要求l 学习从混杂的微生物群体中分离与纯化微生物 菌种的方法。l 综合练习微生物学实验的各种无菌操作技术二、基本原理自然界中各种微生物混杂生活在一起，即使取很少量的样品也 是许多微生物共存的群体。人们要研究某种微生物的特性，首先须 使该微生物处于纯培养状态。
16、微生物的分离、纯化技术是指从混杂的微生物群体中获得只含 有某一种或某一株微生物的过程。微生物的平板分离纯化技术自 1880年被发明以来以有100多年的历史，该技术的建立和发展为人类 获得丰富的微生物资源以及在工、农、医、环境、动物细胞培养等 方面的应用作出了巨大的贡献。平板稀释涂布、平板稀释混合、平 板划线法是分离和纯化微生物的常规方法。分离纯化技术其实是进行平板接种，即用接种环将菌种接至平 板培养基上，或用移液管、滴管将一定体积的菌液移至平板培养基 上，然后培养。平板接种的目的是观察菌落形态，分离纯化菌种， 活菌计数及在平板上进行各种实验时采用的一种接种方法。 本实验是利用分离纯化技术来获得三大类微生物的平板纯培养物， 为下次实验微生物的形态观察提供菌落形态的部分（形态观察主要 包括群体形态（菌落形态）和个体形态观察两个方面。 三、实验材料1、各组所需物品： 无菌培养皿：两包，12套 无菌三角
